西比灵对缺血性神经元胞质内钙离子和细胞活性的影响

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1、西比灵对缺血性神经元胞质内钙离子和细胞活性的影响摘要:目的研究类缺血状态下神经元胞质内游离钙离子及细胞活性变化，探讨缺血性神经元的损伤与细胞内钙离子的关系及西比灵的治疗意义.方法利用Ca2+指示剂Flu-3/AM作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的神经元，共聚焦技术检测细胞内荧光强度的变化，利用四唑蓝（MTT）比色试验检测缺血性神经元的损伤程度.结果给予神经元类缺血处理10min后，缺血组神经元胞质内钙离子浓度和细胞损伤程度明显高于西比灵预处理组（P<0.01）.结论西比灵可明显抑制神经元胞质内钙离子的升高，减轻由此引发的缺血性神经元

2、的损伤程度.　　Key/analysis;ischemia;flunarizine　　Abstract:AIMTostudythechangesofintracellularCa2+andcellactivityandprotectionofSibeliumoncorticalneu-ronsonischemic-likecondition.METHODSNeuronseasuredbyfluorescentintensity（FI）ineachcelli-croscopy，andtheextentofneuronsinjuryinisch

3、emic-likeconditioning，arapidincreaseinfluorescenceintensityic　groupandSibeliumtreatmentgroup，thefluorescenceinten-sityinischemicgrouptreat-mentgroup（P<0.01）.TheAvalueofinjuredneuronsinis-chemicgroupcouldreducetheincreaseof［Ca2+］Iincorticalneuronsandtheextentoftheinjured

4、neuronsafterischemic-likeconditioning.　　0引言　　近年来，细胞内钙离子持续升高介导的缺血性神经元损伤已成为研究者关注的焦点之一.目前认为缺血后神经元死亡主要与通过NMDA型谷氨酸受体-通道复合物的神经毒性和由此产生的钙离子通过电压依赖型钙通道进入神经元有关.Chung等［1］利用免疫组织化学方法发现，全脑缺血2～3d后，N-型Ca2+通道在缺血区表达增强.各种人工合成的钙通道拮抗剂相继用于临床治疗缺血性脑损伤并取得一定疗效，关于其作用机制却知之甚少.我们采用Flu-3/AM为钙离子指示剂，参照Mita

5、ni等［2］法建立培养神经元的类缺血模型，利用激光扫描共聚焦显微镜，监测缺血期间钙离子的变化并采用MTT比色试验检测缺血性神经元的损伤情况，观察钙通道拮抗剂西比灵（sibilium）对缺血神经元的影响，试图探讨钙离子与缺血性神经元损伤的内在关系及西比灵的作用机制.　　1材料和方法　　1.1材料①动物:孕15d昆明种二级鼠由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字003号）.②主要试剂和仪器:胎牛血清由杭州四季青公司提供，DMEM由Gibco公司提供，胰酶由华美公司提供.CO2培养箱由Sanyo公司提供.西比灵由西安杨森公司提供.　　1.2方法　

6、　1.2.1激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿的处理在直径50mm塑料培养皿中央钻一直径10mm的圆孔，将22mm2的盖玻片用加拿大胶粘于孔底部，消毒后使用.　　1.2.2人工脑脊液的配制其组成为（mmolL-1）:NaCl123，KCl3.75，KH2PO41.25，NaHCO326，MgCl21，CaCl22，葡萄糖10，pH7.4.　　1.2.3细胞培养将实验动物引臼脱颈处死，碘酒乙醇消毒腹部，逐层剖开皮肤、肌肉、腹膜取出胎鼠，仔细剥离胎膜羊膜，暴露胎鼠，体视显微镜下剥离脑膜，分离胎鼠大脑脑泡外侧部的皮质，剪碎脑组织，经含125mgL-1

7、的胰酶消化（37℃，15min），离心1000rmin-1，10min，弃上清，200mLL-1胎牛血清的DMEM（Gibco公司）终止消化，以完全培养基（10mLL-1胎牛血清，青、链霉素1×105UL-1）稀释至7×108L-1密度并接种于经多聚赖氨酸（Sigma）处理过的专用培养皿和96孔板，送入50mLL-1CO2的培养箱（Sanyo公司），37℃，培养48h后，加入阿糖胞苷（5mgL-1）以抑制非神经元的继续生长，每隔2d半量换液，培养10d后，可见典型的神经元，经β-tubulin免疫荧光染色显示80%以上细胞为阳性，可认为是纯

8、神经元培养，进行后续实验研究［3］.　　1.2.4类缺血模型建立细胞培养基换为不含糖的人工脑脊液，温度保持在（30±2）℃，混合气体换为含80mLL-1CO2的N2［4］.　　1