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《苯丙氨酸及其衍生物对未成熟神经元胞质游离钙的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、苯丙氨酸及其衍生物对未成熟神经元胞质游离钙的影响【关键词】苯丙酮尿症 【Abstract】AIM:Togainmoreinsightintothemechanismofneuronalinjuryinphenylketonuriapatientsandtoinvestigatetheeffectofphenylalanineonintracellularfreecalciumconcentration(［Ca］i)ofembryonicratcorticalneurons.METHODS:Calciumimagingmol/L)and
2、DLβphenyllacticacid（PL,10mmol/L）decreased［Ca］i,mol/L)decreased,thenincreased,andagaindecreased［Ca］i.DA受体激活，抑制突触前膜谷氨酸释放，抑制突触后谷氨酸能兴奋性电位［1,2］.我科用基因芯片的方法研究了高浓度苯丙氨酸作用下胚鼠皮层未成熟的原代培养神经元基因表达谱的变化,着重观察了基因芯片中钙离子相关蛋白，发现高浓度苯丙氨酸能增加calmodulinⅠ,Ca2+/calmodulindependentproteinkinase,brain
3、typeⅡ,L型Ca2+channel的基因表达，降低calmodulinⅡ,calcineurin,plasmamembraneCa2+ATPase2b和2a的基因表达［3］.因此，本实验拟用钙成像技术检测氨基酸及其衍生物对神经元胞质游离钙浓度的影响. 1材料和方法 1.1胚鼠大脑皮层神经元原代培养孕14dSD大鼠，取出胚鼠，分离大脑皮层，剥除皮层外软脑膜，1.25g/L胰蛋白酶37℃消化10min后，滴入胎牛血清终止消化,加入含B27的神经细胞培养基(Neurobasal,Gibcol).用细口径吸管反复轻吹打，得到细胞悬液，以
4、中等密度接种于0.5g/L右旋多聚赖氨酸包被的盖玻片上，盖玻片预置于35mm的培养皿中，37℃,50mL/LCO2培养箱中培养2～7d备用. 1.2溶液配制标准细胞外液，无钠细胞外液，无钙细胞外液配方见Tab1.L苯丙氨酸（Lphenylalanine,Phe,Sigma），苯乙酸(phenylaceticacid,PAA,Sigma)，苯乳酸(DLβphenyllacticacid,PL,Sigma)用标准细胞外液配成40mmol/L.Thapsigargin(Sigma)用标准细胞外液配成100mmol/L贮存液，保存于-20℃.
5、表1各种细胞外液配方（略） 1.3钙显影方法观察苯丙氨酸及其衍生物对神经元胞质游离钙的影响Fluo4,AM和FuraredTM,AM(MolecularProbeInc.)配成2mmol/L的二甲亚砜(Sigma,纯度999mL/L)溶液，分装后-20℃避光保存备用.这两种染料有相近的激发光波长（约488nm）和不同的发射光波长［Fluo4,(530±15)nm;Furared(640±15)nm］.Fluo4的发射光强度随着胞内游离钙离子浓度升高而增加，而Furared的发射光强度随着胞内游离钙离子浓度升高而降低.平铺于盖玻片上的细
6、胞在细胞外液中洗一次后，与钙指示剂Fluo4（终浓度5μmol/L）和Furared（终浓度5μmol/L）室温下孵育30min,在细胞外液中洗3次后,将细胞置于标本槽中，30min后共聚焦显微镜（LSM510,Zeiss公司，德国）载物台上观察.上述操作避光进行.标本槽为自制的方形有机玻璃皿，底部用石蜡与一薄玻片封接.药品以不同细胞外液配成2倍终浓度保存，1L细胞外液,给药前均记录5min对照，然后将0.5mL的药物沿槽的边缘加入. 1.4荧光图像的记录和［Ca2+］i的计算荧光图像由Zeiss激光扫描共聚焦显微成像系统记录.仪器和
7、软件设置：40×/1.3倍油镜，激发光波长为488nm，CH3和CH4分别是针对485和635nm波长荧光信号的检测通道.激光每隔10s扫描一次细胞，扫描时间1s，每种药记录13min. 通过RegionofInterest测得细胞区域CH3,CH4通道的荧光强度，计算Fluo3的发射光强度与Furared的发射光强度的比值可以反映胞内游离钙的相对浓度，同时可以消除细胞几何形状对胞内钙浓度测量的影响. 1.5数据处理将每1min的6张图像的比值取平均值作为该时间段胞质游离钙浓度（ci），将给药前5min记录的30张图像荧光强度的均值
8、作为胞质游离钙的基础值（c0）,利用以下公式计算每分钟胞质游离钙随时间的变化曲线. 2结果 2.1苯丙氨酸对神经元胞质游离钙的影响由于神经元在静息状态下胞质游离钙有自发性的波动，当胞质内钙在基础值上下1
