细胞工程6原生质体培养和植物体细胞杂交

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1、CELLENGINEERING细胞工程课程初步安排：36学时第一章　绪论4个学时第二章　实验室配置及基本技术2个学时第三章植物细胞工程的理论基础4个学时　第四章　植物组织器官培养技术6个学时第五章　植物细胞培养及次生代谢产物生产3个学时第六章　原生质体培养和体细胞杂交3个学时第七章　人工种子1个学时第八章　植物种质资源离体超低温保存1个学时第九章　　动物组织培养3个学时第十章　　动物细胞融合与单克隆抗体4个学时　　　第十一章　动物组织与胚胎工程1个学时　　　　　　第十二章　试管动物与克隆动物2个学时第六章原生质体培养和植物体

2、细胞杂交原生质体的概念植物原生质体（protoplast）是指除去了细胞壁后的裸露的球形细胞。原生质体能进行植物细胞的各种基本生命活动，如蛋白质和核酸合成、光合作用、呼吸作用以及通过质膜的物质交换等，这极有利于探讨许多细胞生理问题。同时，由于原生质体在诱导条件下能发生融合，离体培养条件下可能再生植株。因此原生质体培养研究在理论上和实践上都具有重要意义。原生质体培养的基本原理原生质体培养的发展历程：-1880年，Hanstein首次使用原生质体protoplast一词-1960年，Cocking首次采用纤维素酶从番茄幼苗的根尖中分离原生质体获得成功

3、-1971年，Takebe等首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株-1985年，Fujimura等获得第一例禾谷类作物－-水稻原生质体培养再生植株-1986年，Spangenberg等利用单个原生质体培养再生植株，在甘蓝型油菜上获得成功据统计，自1971年Takebe首次报道从烟草叶肉原生质体再生植株后，已有49个科160多个属的360多种植物经原生质体培养得到了再生植株。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但已开始从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。原生质体的制备优点：条件温和，原生质体完整性好，得率高等。（一）原生质体的分离--

4、酶解法影响因素：供试材料，酶的种类、浓度以及其组合，酶液渗透压，酶解时间和温度，纯化方法1、材料的来源实践证明，幼嫩叶片，萌发种子的下胚轴、子叶以及愈伤组织和悬浮培养物等均是原生质体的良好来源：--叶肉细胞是分离原生质体的较好材料，从叶片中可分离出大量的较均匀一致的原生质体。由叶片制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要一般选用植株上充分展开的叶片；--愈伤组织和悬浮细胞系，由于其生长快速稳定，受环境条件的影响不大容易获得大量高质量的原生质体。细胞系建立时间的长短，继代培养的时间和培养基的成分等都影响原生质体分离的数量和质量。一般选用结构疏松

5、并处于对数生长期的细胞分离原生质体的效果较好。外植体材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射以及预培养等方法，可以提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同：--龙胆试管苗只有用4℃处理后分离的原生质体才能分裂；--甘蔗植株只有在黑暗条件下培养12小时后分离的原生质体才能分裂；--马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48小时后分离原生质体，才会获得较高的原生质体产量。2、预处理及酶解酶酶解渗透压调节剂酶来源生产厂家纤维素酶类onozukaR–10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulys

6、in绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Phi

7、ladelphia,PA19105,USAHemicellulase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA原生质体分离常用的商品酶甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等--调节酶液渗透压，使其与所处理细胞的渗透压相似，保证原生质体活力，使用浓度根据植物材料而异，一般在0.2~0.8mol/LCaCl2·2H2O，KH2PO4，MES（2-氮吗啉乙烷磺酸），葡聚糖硫酸钾--提高原生质体膜的稳定性AgNO3、过氧化物歧化酶(SOD)--减轻酶解时产生的乙烯、氧自由基对细胞膜的损伤牛血清蛋白--可防止细胞壁降解过程中对细

8、胞膜和细胞器的破坏酶解时间酶浓度酶解温度利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间获得大量而有活力的原生质体！酶解过程一般为将酶解材料放入