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SRG基因的克隆及原核表达物质分解清除.如果Dc内吞坏死物质过多,往往不能将其充分溶解吸收,这亦可导致DC的坏死或凋亡.以上不同培养时问的Dc在透射电镜下超微结构和功能状态的表现,证实利用连续贴壁法分离培养的细胞,具有Dc典型的结构与多种功能表现.【参考文献】【1]BanchereauJ,SteinmanRM.Dendriticcellsandthecontrolofim—mumty[J].Nature,1998,392:245～250.[2]NishiokaY,HuaW,NishimuraN,eta1.Geneticmedificatonofdendriticcellsanditsapplicationforcancerimmunotherapy[J].JMedInvest,2002,49(1/2):1一l7.【3]lna~aK,InabaM,RomaniN,eta1.Generationoflargenumbersofdendriticcellsfrommousebonemarrowculturessupplementedwithgranulocyte/macrophagecolony—stimulatingfactor[J].JExpMed.1992.176(6):1693—1702.SRG基因的克隆及原核表达闰露',高萍,栗艳,鱼兵CloningandprokoryoticexpressionofSRGMODERNONCOLOGY.Mar.2007,VOI.1.SailustoF,LanzavecchiaA.Eficientpresentationofsolubleantigenbyculturedhumandendriticcellsismaintianedbygranuloeyte/macrophagecolony—?stimulatingfactorplusintedeukia'-4anddownregulatedbytumornecrosisfactor[J].JExpMed,1994,179(4):1109～1117.KoidoS,HaraE.HommaS.eta1.Dendriticcellsfusedwithallo.geneiceoloreetalcancercelllinepresentmultiplecolorcctalcancer —specificantigensandinduceantitumorimmunity~instautolo-goustumorcells[J].ClinCancerRes,2005,11(21):7891～790o.张红梅,张利旺,贾军,等.肿瘤患者自体血浆诱导树突状细胞的实验研究[J].现代肿瘤医学,2005,13(6):740～743.张利旺,张红梅,贾军,等.以AFP为靶点的肝癌树突状细胞免疫治疗的实验研究[J].现代肿瘤医学,2005,13(6):736—739.YANLu,GAOPing,LIYan,YUBing'DepartmentofPharmacy,CenterofRehabilitation,ngHospital,￡FourthMilitaryMedicalUniversity,Xitm710033;DepartmentObstetricsandGynecology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi"an710038;'OrthopedicsOncologyInstituteofChinesePLA,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xitm710038,China.【Abstract】0bjective:Toclone,expressandidentifyhumanSRGgene.Methods:TotalRNAwasextractedfromhumanosteosarcomacellsandthefu11lengthcDNAofSRGwasobtainedbyRT—PCR.TheSRGgenewasclonedin.topGEM—T—Easyvectorandsequenced.ThenthegenewasinsertedtoBamHIandSalIsiteofpET一28(a+)expressionvectortoconstructtheexpressionvectorwhichwastransformedintoE.coilBL21.Aftertl1etransformedbacteriawereinducedatIPTGfor2—6htheexpressedproteinwasanalyzedbySDS—PAGE.Results:DNAsequen.cingresultsshowedthatSRGgenewasexactlyconsistentwiththesequencereportedinGenBank.SDS—PAGEana1. ysisdemonstratedthatSRGproteinwasexpressedinE.coliandtherelativemolecularmassofitwas22kDa.Theproteinbandamountedto25%oftotalbacteriatotalprotein.Condusions:TheresultsshowthatSRGgenehasbeensuccessfullyclonedandexpressed.ItlaysafoundationforfurtherstudiesoftheapplicationsofSRGintheosteosarco.madiagnosisandtherapy.【Keywords]SRG;RT—PcR;geneexpressionModemOneology20o7,15(3):O30I4～o3O6【摘要】目的:克隆SRG基因,原核表达并鉴定.方法:从培养的人骨肉瘤细胞SOSP～9607中提取总RNA,经RT—PeR获得SRG基因.将该基因克隆到pGEM—T—Easy克隆载体中,测序,鉴定.将测序正确的SRG基因亚克隆到pET一28(a)表达载体中,构建SRG表达载体,IPTG诱导表达2h～6h,做SDS—PAGE分析,鉴定SRG蛋白的表达.结果:DNA测序证明,获得了SRG基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致.SDS—PAGE分析表明,SRG蛋白获得高效表达,其相对分子质量为22kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%.【收稿日期】2006—06一O1I基金项目】国家自然科学基金重点资助项目(30330610)【作者单位】第四军医大学西京医院康复诊疗中心药剂科,陕西西安710033第四军医大学唐都医院妇产科,陕西西安710038第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究,陕西西安710038I作者简介】日露(1975一),女,陕西西安人,主管药师,硕士,研究方向:基因药物研究.]]]J1J现肿j囟学2007年3月第15卷第3期 结论:SHG皋目的克隆羊¨袁选均非得n疽功.为进一步探讨SRG基I在骨肉憎渗治中应用奠定r肇础【关键词lSRG基因;逆转录PCR;基IH表达【中图分类号】R73023【文献标识码】A【文章编号】1672—4992一【2007)03—0304—03凋亡足绑胞的程序化北亡.阑亡过程的启动与实施涉段一系列复杂的:化反应,井受多种分子渊节,哒屿分子的异常表达和1功能映陷与肿瘤的发发展有..掏亡摹因和凋亡抑制基因的某些特征使其成为肿瘤发生发展研究搜肿瑶治疗中具有吸引力的新靶点巾捅亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins,IAP)家旌成员中的Survlvin(存活素)在肿痛发,发腿过rf】的作用已受到r学者们的广泛关注并报也较多SRG(Su~'ival一latedgene)足新近发现的橱亡抑制基因家威的新成员".为丁进一步探讨其在肿瘤发l研究,骨肉瘤的凋亡靶向清疗技顶届削断1,呐用价值.我们时该基岗进丁克隆.并在原棱表达载体中进fr高散表达1材料和方法1.1材料^,骨肉娟细胞SOSP一9607,pEr一28'a')原核表达载体和大肠杆菌J~I】09B12J蒲株均为率研究窜保存.IIq'GX—gal,限制性内切孵及胰蚩酶均购于宦生物工程(大连j有姒公司,pGEM一1'一Easy载体,T4DNA连接雕,,精质粒提取试剂盒技I)NA腔回收试卉u盒,逆转录试剂盒均购j:Pmmega公司.纲1地总RNA提取试剂TRIzol购于Gil~o公司.12方法l2.1PCR引物设计撤据Genbankh{1SRGeDNA序列,|殳计了一时『物.【游引物序列:5一GCGCATCCATGCT—TC'ITCGCTGGTG一3F蝣引物序列:5GGGTCGACTCAG. GAGGCFCTGGTAG一3在上游和下蝣引物5端舟j;II加入了BamHI和SalI酶切值点,以使于克隆..弓I物tlJJ:海培康生物有限公司台成.1.2.2骨肉瘤细胞SOSP一9607的培养及总RNA的提取取人骨肉缩细胞SOSP一9607忤通RP[MI640常伽培养,埔养至第3II25g/L磷酶消化细胞计传代培斧,以调蝼细胞长状态,第5口换减.第6¨消化收集洗涤,沉淀后,以TPd~L试剂提取细胞总RA(详l见试l操怍醣明):1.2.3目的基因的RT—PCR和PCR秉』HPromega公?的逆转录试剂盘.梭产晶兑叭书操作."反转采体系始RTPCR备SRGcI),^.反应如:墩总RNA15Ixg,oligo,rl,2.混匀后7O℃1[]rain球惜2min加5倍逆转录缓冲液5v.I,10mmol/]dNTI'2I.LI,RNA酶抑制剂2VI.逆转录蔺(MIV—RT}40U混盘』后421二水浴60min冰浴2mirt.70t加热10min后模扳制备完毕以所制备SRGeDNA为模板进行PCR扩增反碰反应悻系如r:模板cDNA1I,10倍缓冲液5V.I,25mmol/LMl5】,下引物(J0pmol/I)2"】,TaqDNA集合孵1l,10mmol/II』NlP2.加HO补足至总体积50.反应条件为:94℃5min,56℃2min.72℃2mi『194.七Imin,56qC1mi.,72gE2rain35个循环.衄后72℃继续延伸10min取5PCR产物,在古0.5m』演化乙链(EB的琼脂糖凝胶(15Lj中l乜泳分析.紫外观测仪观察缔果.1?2.4SRG基因的克隆及刮序DNA胶l田收纯化试剂盒将PCB.投得曲DNA片段纯化(详见试剂盒说明)后与pGEM—T—Easy垃接,转化JM109菌株,衍临n斑筛选,提取色茼落重组质粒DNA以Bamlll和Sall酶切鉴定后筛选出捕八E】的片段的l瓢性克隆.然后进行I)NA测序将获得的 IE确重组克隆命名为pGEM—T—Easy—SRG北京-tO远志程技术公司4序1.2.5SRG表达载体的构建和诱导表达将测序确的pGEM—T—Easy—SRG质粒,1tJBaml【T和S~alI烈酶切所收同肿片段.经州同内切牌消化处的pET一28【a+)裁体质粒连接后转化JM1o9菌株.提取甫组质粒DNA,以Bam[11ISal1}辘f切定后,将得到插人片段的正确克隆命为p耵一SRG将pET—SRG丧达砸牲转化感受态B12I(DE3),挑取蒋接种于含邶晖索f100.1g/I)的LB蚺养旗Il1.37cc化过夜,次l1投I:10的比例转接.37℃培骅至A约08,加八[PTG至终浓0.8mrrml/l,30℃诱导培养2h～6h,离心收集小¨n段荫伴,做SDS—PAGE分析.考{斯舞菔染色,脱色后脱寮2结果2.1RT—PCR产物的鉴定以逆转录台成的eDNA为幞板进行PCR扩增PCll电泳结果显示一条约为516bp大小的特钟性条带:.此DNA带IlSRG基闽的大/l,.1'll符台,图巾未见有j￡他特异扩增带H{现(12.2SRG表达载体的构建殛鉴定删序正确的SIIG旌片段.jp—ET28(a+)戟体连接转化后提取获得的重组质牲1一SRG,以投怖鉴定.牲定结果地图2阁中显示.箍定的3个重组质粘巾都禽柏约516bp的插人片断.从itiiill!l~齄已捅八表达载体.2.3SRG基因大肠杆菌中的诱导表达SDS—PAGE牲定结果见3,禽雨纽质靛T—SRG的太街杆菌BL21IPTG匮导后随体总蛋F1裂解变性12%SDS—I'AGE观察到一分子量与理论他(22ku)符舯明诱导丧逃带,K~lak软什分}行丧}蛆在【P,rc浓度为08mmoI/I. 3[]℃压导4h条件下此蛋Ii表达量约为茼.拦门的25%I:PCi~Mak:2SRG囤lSRG的RT—IR扩增蛄秉Fig1lit]N2Rm.~ultsofSRG『_—■I…__-●【:Maker:2:pET—SRt;/iCamH]andII蛋2pEr—SRC重蛆盾柱酶切鉴定蛄果Fig2[denlificationofpET—SR(by地slnrfmnenry~ledigP~tkma123497.4——.6Bl03f020I鬻遗拇,礴囊'自'1:Proleinmaker:2.3:ExpmsshmofpET—SRGinducedby[PTGIor2,4htively4:Expressiono1"pET一28(a)inducedbfIPTGlr4h图3SDS—PACE坚定结果Fig3AnalysisofSDS—PAGE3讨论绑胞州是胞细胞外或细胞内情号导F发叶i帕L动自杀北亡过程,生理情况下,细胞是细胞内的一些编琏罔柠制的在特定IE[fir],特定顺l}致特定问范嗣内 发的细胞死(如胎发育iIr细胞的程序rI:北亡,成凡的激素依帧进化,细胞的老化袅1.等.衙在泉摘蝉情兄,胞则昆…f其爿叫乜粕他启动r禁狮亡机制的魑l,从I酊导敛丁细胞测亡t如某衅瘸性疾病的细胞损伤,宴质*官拥萎缩等)外界刺激餐过复朵情号转导系统址八纲胞核.活化删材J荚基的表达+聃勒亡程序.最终I}I鲧H:枝酸酶滑核小体断DNA谜.导敛一系别洲l1:剖改变嗣亡纲1抱的形态学改变要在啦性:染色雁晰榘边缘化.梭商J韭凝集.染色体J.梭小休连接l《被丽t玎造成DNA链断莘2.形成碎片,耐亡小体形成群删址一种基因控制的细胞自主性n々死亡过程.娃维持境稳定的吐要机制之一纲胞死亡嘲拄机;肢信转导系统的研究发现,多种基因及其表达J物与细胞北亡过程有符救为桁嘲竹关系,他们依次有的这个高度榉化进程的阶段丧达这些萆困I戚存和死E.基因,它1互作用帕结粜决定细胞曲牛此龠运,r觑这M0nER('NCOlOGYMar2007.V()I.I5,O3衅捌亡丽控肚因的{将导致细胞生嗣1托亡帕火衔.'多研究丧H月.辑种鼎囡和抑瓣荜扯呻蝴发叫-I-的作J1】E要是堰过婀凋I千"细胞增殖过程来完成的.¨SRG基阚住J=人染包伴Ip36.编码172氨牲陵残主要分布于横心边,NortherbIotling分析表驯,该基大多数肿瘤组织均高表达l在除脏$11Jlff盘外的l}常-qi~1均较低表达.研究表明.SRG的扰稠亡作用与hel一2极为相似,但其表达的水平对bcl一2,bcl一1和blm的表达并性有影响.因此.钮}究者摊沦认为SRG的抗凋亡机制是不依赖于bcl2家旗战员的,SRG对嗣亡的确切的揭亡机制莆进一步研究.以往研究为1I一2足亡的iII觚黼节子,大多数的』lll】鼎}1融?lI总是过表达".针埘bcl一2曲压义 核陵或小拍bcl2抑0剂等渐均硅爪山J良好构成川前景.In此我们{{i.断,SRGr曲l嘶发1.tli分子物学机制破闸驯,一定全匀肿婀治疗t:静米新}疔策略"本研究通过成川人骨_匍馏细胞时SRG进行r克隆『1J用米探讨SRG其他肿瘤发1桁tu卡¨炎的1了的lr_作用,利用SiRNA技术降低填衷达作为P1陶痛肇治疗撕疗法.为进一步探讨snc捌亡技肿刑发,I1的机制怕建新的肿瘤治疗策略用l开发新I均q.物治疗药物蜷定良实验基础.【参考文献】l1JGuplaSMd~'ularsignalinginde~threeepmr蚰dmito~h帅IIrialpathwaysafmptosislJ.lntJOneo1.2003.22t_I:I5～20[2]Ha~nstetter^[zuml_sl"~wardIulllp叩【懈…wdl…L1mo~Mity[J].CimRes,200[).86(4):37I～376[3.YuanZl1.WangR.SolomonJ.0,hlentificafionIdLh一-【.Jznofsu~,ivalmlatedgene.dnc~ve[cellsu~,ivul~erlecontrol-1ingalX}pL{~isandmmorigmn~isJCamrrltes.如[I5.65f23,:l()7l6—1c】7244VxDL.StmsserA11lmoll~liI[~rbM-时'"al}~:glasJs[J】rHNailAea1Sci.1996.93c6:2239～22445SalihHKienerP3*Alterali~msinrl(【H5,^l一1】andFLigand【CDI78)expre~i,:,ninLlleprl,myehxylilleukemillduringt~atmenlwithAPRAJukI,ymphama2{X}a.459,:1:55—59[6]jRM.A~ndsMJ.1_il)Wirl~njJ,?K…Iml¨H'Ⅲigen~?exhibilstunl{l~suppT~tI1(tivilydsils¨hsenlpn:lnl01e,hm~fi.gBn~isinmurine【es【JJMnICan{rItP.2003.1:820,825[7]Ding1IF.FisherDEInduetill『lI-fIhl(l¨川Ihem. 1uIl_nplm~rhmifiesIJI^…iⅥ¨I.21)0234l6:451～469[8:Nm's,JenVS.EkerlrIr.Va¨I'|II1M¨fRtl一2re~.ul¨HIaIhlsand【I【Hthromecn:1….d¨?xrurindependenIly(|fholheasp~e一2andeaspase91JlJcellBil】【2()04.165l6J:775—7809An,Je~.nBIH,SvmwIN.K,'istlu:,rgP."r'fImrattnng~-"ieitv,lfBcl2in'a¨(?e[xltientslJlB?{2003,I115I2)728—734.1()jHclcken|mDlM.cilICD,《)NeillJW"fMLllx,hnmlri日andapoptosis:…Ihera,t~ulicI,Eirge~fJ^dCancerltes200285203—242
