活化notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化的体外研究的论文

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1、活化Notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化的体外研究的论文[摘要]目的探讨活化notch2信号对高糖条件下核因子κb受体活化因子配体（rankl）诱导破骨细胞分化的影响，　　初步明确notch2信号在高糖条件下破骨细胞分化中的作用。方法体外培养小鼠破骨前体细胞，在高糖条件下采用rankl刺激破骨前体细胞。实验分为葡萄糖和甘露醇等渗对照组，每组设5个浓度（0、5、10、20、40mmol·l-1），　　通过实时定量聚合酶链反应检测notch2基因的表达水平，抗酒石酸酸性磷酸酶（trap）染色检测破骨细胞分化情况。构建含notch2细胞内片段（i2

2、）的病毒载体（pmx-i2），转染包装细胞，收获病毒上清液感染破骨前体细胞；将病毒载体分为i2-oe（i2过表达）和empty（仅感染pmx载体）两组，通过蛋白质印迹法检测i2蛋白的表达水平；并在高糖条件下（20、40mmol·l-1）用rankl刺激i2-oe和empty组，设甘露醇等渗对照组，用trap染色检　　测破骨细胞分化情况。结果rankl诱导破骨细胞分化过程中，葡萄糖浓度为20、40mmol·l-1时，破骨细胞数分别为110.3±6.8和72.0±8.0，notch2相对表达量分别为1.65±0.23和1.10±0.11；20、40mm

3、ol·l-1甘露醇组的破骨细胞数分别为152.7±7.0和157.0±12.5，notch2相对表达量分别为2.82±0.28和2.42±0.27，组间差异有统计学意义（p<0.05）。　　活化notch2信号后，葡萄糖浓度为20、40mmol·l-1时，i2-oe组破骨细胞数分别为206.7±7.8和178.3±11.5，empty组分别为102.3±8.7和76.0±10.1，组间差异有统计学意义（p<0.05）。.结论活化notch2信号可促进高糖条件下破骨　　细胞的分化。　　[关键词]notch2信号；高糖；破骨细胞分化　　[中

4、图分类号]q25[文献标志码]a[doi]10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.007　　研究[1-2]发现：破骨细胞不仅是唯一能进行骨吸收的细胞，而且是参与牙槽骨组织改建的主要功能细胞。破骨细胞来源于骨髓造血干细胞，由单个核前体细胞融合而成。在破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中，不仅受到包括核因子κb受体活化因子配体（receptoractivatorofnuclearfactorkappabligand，rankl）激活的notch2在内的多种信号传导通路的调控[3-4]，而且受到包括血糖浓度在内的多种微环境因素的调控

5、[5]。目前，有关notch2信号在高糖条件下对破骨细胞分化情况的影响还不清楚。因此，探讨高糖条件下活化notch2信号对破骨细胞分化的影响，不仅可以明确notch2信号在糖尿病状态下牙槽骨改建中的作用，并且可以为寻找糖尿病性牙周炎的治疗方法提供新思路。　　1材料和方法　　1.1材料和试剂　　293t细胞；α-mem、dmem、特级胎牛血清、聚凝胺（polybrene）（sigma公司，美国），rankl、巨噬细胞集落刺激因子（macrophagecolonystimulatingfactor，m-csf）（peprotech公司，美国）；pmxs

6、（cellbiolabs公司，美国）；lipofectamim2000、trizol试剂（invitrogen公司，美国），sybrgreen试剂盒（takara公司，日本），notch2细胞内片段（intracellu-larfragmentofnotch2，i2）抗体（cellsignaling公司，美国），t-per组织蛋白提取试剂和bca蛋白分析试剂（pierce公司，美国）；聚偏二氟乙烯（polyviny-lidenedifluoride，pvdf）膜（millipore公司，德国）。　　1.2细胞培养　　取4周龄sd雄性大鼠，断颈处死，

7、无菌条件下分离完整的股骨和胫骨，暴露髓腔后用α-mem培养基（含10%胎牛血清）冲洗骨髓腔数次至骨干发白为止，然后接种于10cm大小的培养皿中，在标准条件（饱和湿度、5%co2、37℃）下培养12h后收集非贴　　壁细胞，1500r·min-1（离心半径15cm）、37℃离心　　5min，弃上清液，视为破骨前体细胞[3]，加入m-csf　　（20ng·ml-1）和rankl（30ng·ml-1）诱导其向破骨细胞分化。293t细胞用dmem培养液培养。　　1.3高浓度葡萄糖刺激　　按照浓度依次增高的顺序，设置0、5、10、20、　　40mmol·l-1

8、共5个葡萄糖梯度，同时设置相对应的0、5、10、20、40mmol·l-1甘露醇梯度，作为等渗对照。　　1.4含i2基因的