活化notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化体外探究

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1、活化Notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化体外探究［摘要］目的探讨活化Notch2信号对高糖条件下核因子kB受体活化因子配体（RANKL）诱导破骨细胞分化的影响，初步明确Notch2信号在髙糖条件下破骨细胞分化中的作用。方法体外培养小鼠破骨前体细胞，在高糖条件下采用RANKL刺激破骨前体细胞。实验分为葡萄糖和甘露醇等渗对照组，每组设5个浓度（0、5、10、20、40mmol•L-1）,通过实时定量聚合酶链反应检测Notch2基因的表达水平，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨细胞分化情况。构建含Notch2细胞内片段（ICN2）的病毒载体（

2、PMX-ICN2）,转染包装细胞，收获病毒上清液感染破骨前体细胞；将病毒载体分为ICN2-OE（ICN2过表达）和EMPTY（仅感染pMX载体）两组，通过蛋白质印迹法检测ICN2蛋白的表达水平；并在高糖条件下（20.40mmol・L-1）用RANKL刺激ICN2-0E和EMPTY组，设甘露醇等渗对照组，用TRAP染色检测破骨细胞分化情况。结果RANKL诱导破骨细胞分化过程中，葡萄糖浓度为20、40mmol・L-1时，破骨细胞数分别为110.3±6.8和72.0±8.0,Notch2相对表达量分别为1.65±0.23和1.10±0.11；20、40mm

3、ol・LT甘露醇组的破骨细胞数分别为152.7±7.0和157.0±12.5,Notch2相对表达量分别为2.82±0.28和2.42±0.27,组间差异有统计学意义（P0.05）；葡萄糖浓度分别为5、10mmol・L-l时与等渗甘露醇组间的差异无统计学意义（P>0.05）,随着葡萄糖浓度的继续升高，破骨细胞数目减少，葡萄糖浓度为20、40mmol・L-1时与等渗甘露醇组间的差异具有统计学意义（P0.05）；葡萄糖浓度分别为5、10mmol・L-1时与等渗甘露醇组间表达的差异无统计学意义（P>0.05）,随着葡萄糖浓度的继续升高，Notch2受体表达

4、逐渐降低，葡萄糖浓度为20、40mmol・L-l时与等渗甘露醇组间的差异具有统计学意义（P〈0.05）。该结果提示高糖环境可以抑制RANKL诱导的Notch2受体表达。2.3活化Notch2信号促进高糖环境下RANKL诱导的破骨细胞分化PMX-ICN2表达载体经XbaI酶切，得到预期大小分别为1587、2619、4299bp的片段，结果如图2所示，初步表明逆转录病毒载体pMX-ICN2构建成功。对DNA测序结果进一步分析表明此重组表达载体构建正确。从图3中可看出：与EMPTY组（感染pMX空载体病毒上清液）细胞相比，ICN2-0E的ICN2表达水平升

5、高，该结果提示Notch2信号被活化。从表3中可以看出：活化Notch2信号后，甘露醇浓度为20、40mmol・LT时，ICN2-0E组破骨细胞数量多于EMPTY组，两组间的差异有统计学意义(P〈0.05)；葡萄糖浓度为20、40mmol・L-1时，ICN2-0E组破骨细胞数量多于EMPTY组，两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)；但是在20、40mmol・L-1时，ICN2-0E组破骨细胞数量少于对照组(等渗甘露醇浓度组)，且二者间的差异具有统计学差异(P〈0.05)。该结果提示活化Notch2信号不但可以促进高渗状态下RANKL诱导的破骨细

6、胞分化，而且可以促进高糖环境下RANKL诱导的破骨细胞分化，但活化Notch2信号不能够完全阻止高糖对破骨细胞分化的抑制作用，说明可能有多种信号途径参与了高糖抑制破骨细胞分化的过程。3讨论国内外有关高糖刺激对体外破骨细胞分化影响的研究结果仍不一致。一方面，有研究［5］表明高浓度葡萄糖通过提高破骨前体细胞表面核因子kB受体(re-ceptoractivatorofnuclearfactorkappaB,RANK)的表达水平，从而促进RANKL诱导破骨细胞的分化及其骨吸收功能；另一方面，也有研究［6］表明高浓度葡萄糖通过降低细胞核因子kB(nuclear

7、factorkappaB,NF-kB)的活性而抑制破骨细胞分化。破骨前体细胞在向破骨细胞分化的过程中，受到多种信号通路的精确调控以及所处微环境的综合影响。破骨前体细胞向破骨细胞分化及其骨吸收过程中，需要葡萄糖作为基本的能量代谢物质。根据预实验结果和以往的文献报道[7],人体内正常血糖浓度大约为5.5mmol・L-1,本实验选择葡萄糖浓度为5、10、20、40mmol・LT的a-MEM培养基培养破骨前体细胞。从本实验的研究结果可以看出，各组均有破骨细胞形成，随着葡萄糖浓度的升高，多数实验组破骨细胞的数量少于等渗对照组，二者间差异具有统计学意义。这说明R

8、ANKL能诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化，而高糖环境可以抑制破骨细胞分化，并且呈现出浓度依赖性，总体趋势是浓