活化notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化的体外研究

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1、活化Notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化的体外研究[]目的探讨活化Notch2信号对高糖条件下核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导破骨细胞分化的影响，　　初步明确Notch2信号在高糖条件下破骨细胞分化中的作用。方法体外培养小鼠破骨前体细胞，在高糖条件下采用RANKL刺激破骨前体细胞。实验分为葡萄糖和甘露醇等渗对照组，每组设5个浓度（0、5、10、20、40mmol·L-1），　　通过实时定量聚合酶链反应检测Notch2基因的表达水平，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨细胞分化情况。构建含Notch2细胞内片段（I2）的病毒载体（pMX-I2），转染包装细胞，收获病毒

2、上清液感染破骨前体细胞；将病毒载体分为I2-OE（I2过表达）和EMPTY（仅感染pMX载体）两组，通过蛋白质印迹法检测I2蛋白的表达水平；并在高糖条件下（20、40mmol·L-1）用RANKL刺激I2-OE和EMPTY组，设甘露醇等渗对照组，用TRAP染色检　　测破骨细胞分化情况。结果RANKL诱导破骨细胞分化过程中，葡萄糖浓度为20、40mmol·L-1时，破骨细胞数分别为110.3±6.8和72.0±8.0，Notch2相对表达量分别为1.65±0.23和1.10±0.11；20、40mmol·L-1甘露醇组的破骨细胞数分别为152.7±7.0和157.0±12.5，Notch2相

3、对表达量分别为2.82±0.28和2.42±0.27，组间差异有统计学意义（P<0.05）。　　活化Notch2信号后，葡萄糖浓度为20、40mmol·L-1时，I2-OE组破骨细胞数分别为206.7±7.8和178.3±11.5，EMPTY组分别为102.3±8.7和76.0±10.1，组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论活化Notch2信号可促进高糖条件下破骨　　细胞的分化。　　[关键词]Notch2信号；高糖；破骨细胞分化　　[]Q25[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.007　　研究[1-2]发现：破骨细胞不

4、仅是唯一能进行骨吸收的细胞，而且是参与牙槽骨组织改建的主要功能细胞。破骨细胞于骨髓造血干细胞，由单个核前体细胞融合而成。在破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中，不仅受到包括核因子κB受体活化因子配体（receptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand，RANKL）激活的Notch2在内的多种信号传导通路的调控[3-4]，而且受到包括血糖浓度在内的多种微环境因素的调控[5]。目前，有关Notch2信号在高糖条件下对破骨细胞分化情况的影响还不清楚。因此，探讨高糖条件下活化Notch2信号对破骨细胞分化的影响，不仅可以明确Notch2信号在糖尿病状态下牙槽骨改建

5、中的作用，并且可以为寻找糖尿病性牙周炎的治疗方法提供新思路。　　1材料和方法　　1.1材料和试剂　　293T细胞；α-MEM、DMEM、特级胎牛血清、聚凝胺（polybrene）（Sigma公司，美国），RANKL、巨噬细胞集落刺激因子（macrophagecolonystimulatingfactor，M-CSF）（Peprotech公司，美国）；pMXs（CellBiolabs公司，美国）；LipofectamineTM2000、TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国），SYBRGREEN试剂盒（Takara公司，日本），Notch2细胞内片段（intracellu-larf

6、ragmentofNotch2，I2）抗体（CellSignaling公司，美国），T-PER组织蛋白提取试剂和BCA蛋白分析试剂（Pierce公司，美国）；聚偏二氟乙烯（polyviny-lidenedifluoride，PVDF）膜（Millipore公司，德国）。　　1.2细胞培养　　取4周龄SD雄性大鼠，断颈处死，无菌条件下分离完整的股骨和胫骨，暴露髓腔后用α-MEM培养基（含10%胎牛血清）冲洗骨髓腔数次至骨干发白为止，然后接种于10cm大小的培养皿中，在标准条件（饱和湿度、5%CO2、37℃）下培养12h后收集非贴　　壁细胞，1500r·min-1（离心半径15cm）、37℃离

7、心　　5min，弃上清液，视为破骨前体细胞[3]，加入M-CSF　　（20ng·mL-1）和RANKL（30ng·mL-1）诱导其向破骨细胞分化。293T细胞用DMEM培养液培养。　　1.3高浓度葡萄糖刺激　　按照浓度依次增高的顺序，设置0、5、10、20、　　40mmol·L-1共5个葡萄糖梯度，同时设置相对应的0、5、10、20、40mmol·L-1甘露醇梯度，作为等渗对照。　　1.4含I2基因的逆转录病毒载体pMX