肥胖抑制素对大鼠心室肌细胞收缩及l型钙通道的影响

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1、肥胖抑制素对大鼠心室肌细胞收缩及L型钙通道的影响：孙强，胡浩，周筠，于小江，臧伟进，陈晨【摘要】目的探讨肥胖抑制素(obestatin)对心肌细胞收缩、细胞内钙瞬变及细胞膜L型钙通道的影响。方法采用单细胞收缩/荧光边缘探测系统及全细胞膜片钳技术观察obestatin对急性酶解分离大鼠心室肌细胞收缩及钙信号的影响。结果10-7mol/Lobestatin增强大鼠心室肌细胞收缩幅度[(26.43±6.13)%]及细胞内钙瞬变幅度[(21.33±4.73%)]，并增强ICaL峰值。结论Obestat

2、in开放心肌细胞膜上L型钙通道，促进钙内流，增强大鼠心室肌细胞ICaL及细胞内钙瞬变，进而增强大鼠心肌细胞收缩。【关键词】obestatin;心室肌细胞;钙瞬变;L型钙电流　　ABSTRACT:ObjectiveTostudytheeffectsofobestatinonthecontraction,calciumtransientandLtypeCa2+current(ICaL)inratventricularmyocytes.MethodsTheextentofcontractiona

3、ndCa2+transientchangesotionedgedetectionsystem,andLtypeCa2+currentptechnique.ResultsObestatinof10-7mol/Lincreasedthecontractionamplitudeofventricularmyocytes(26.43±6.13)%andCa2+transientamplitude(21.33±4.73)%,andenhancedICaLpeak.ConclusionObestatinca

4、nstrengthencontractilitythroughincreasingICaLandCa2+transientinratventricularmyocytes.　　KEY购自美国Invitrogen公司，obestatin购自澳大利亚AlexisBiochemicals公司。其他试剂均购自Sigma公司或Merck公司。　　正常台氏液(mmol/L)：NaCl136.9，KCl5.4，MgCl21.0，HEPES10，NaH2PO40.33,glucose10.0，pH用NaOH调至7

5、.4;KB液(mmol/L)：KCl25;taurine20;Lglutamicacid70;KH2PO410;MgCl23.0;EGTA0.5;glucose10;HEPES10;pH用KOH调至7.35;记录钙电流细胞外液(mmol/L)：NMDG136,CsCl5.4,MgCl21.0，CaCl22.0，NaH2PO42.0，glucose10，HEPES10，pH用NMDG调至7.3;记录钙电流电极内液(mmol/L)：CsCl20，cesiumaspartate110，MgCl21.0，

6、HEPES10，EGTA10，GTP0.1，MgATP5;pH用CsOH调至7.2。　　1.3方法　　1.3.1单个心室肌细胞的分离常规酶解法分离成年大鼠心室肌细胞[3]。其步骤简述如下：戊巴比妥钠(40mg/kg，ip)麻醉后大鼠，迅速开胸取出心脏并固定于Langendorff灌流系统。经主动脉灌流(37℃)含氧无钙台氏液，心脏停跳后，换以含0.5g/L胶原酶Ⅱ和1g/L牛血清白蛋白(BSA)的无钙台氏液灌流约18min，待心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后再以KB液灌流冲洗残留酶液约3min。

7、去除心房及主动脉并将心室组织置于含氧KB液中，将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经250目筛网过滤细胞悬液，室温静置30min后复钙备用。　　1.3.2心肌细胞收缩的检测心室肌细胞收缩采用IonOptix单细胞动缘探测系统(IonOptix公司,美国)同步检测心肌细胞收缩及钙瞬变[6]。将心肌细胞置于倒置显微镜(Nikon)载物台上的细胞灌流小室内，以含氧台氏液(2mL/min，22℃)灌流。给予0.5Hz，5ms波宽的电场刺激，场刺激由灌流槽两侧镶嵌的铂电极产生，细胞收缩影像通过40×物镜传

8、输到IonOptix的MyoCam照相系统并呈现在监视器上。心肌细胞肌小节收缩幅度和收缩/舒张速度等指标由计算机自动实时采集并记录。选取细胞边缘折光性好、横纹清晰、无自发收缩、功能良好能随电刺激稳定收缩的心室肌细胞进行实验观察。给药前细胞收缩幅度恒定至少5min以上。　　1.3.3心肌细胞钙瞬变的检测将Fura2/AM(0.5μmol/L)与心肌细胞避光孵育15min(22℃)，采用双激发荧光光电倍增系统(IonOptix，美国)检测荧光信号，75的滤光片到达0.5