多巴胺诱导pc12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析

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1、多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析　　摘要:目的研究帕金森病（PD）多巴胺能神经元的死亡机制.方法在免疫组织化学基础上，采用流式细胞仪、电泳及电镜技术观察不同浓度多巴胺（DA）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的超微结构及生化改变.结果适当浓度DA可诱导PC12细胞凋亡.早期表现为线粒体结构及功能的改变并有抗凋亡蛋白bcl-2的表达，后期电镜下可见凋亡特征性核结构改变及典型的DNA“阶梯状”电泳带.结论细胞凋亡参与了PD的病变过程，线粒体在早期细胞凋亡中起着重要的调节作用.　　Keyine　　

2、Abstract:AIMTostudythemechanismofdopaminergicneuronaldeathofParkinson’sdiseases（PD）.METHODSUsingthefloetry，electronmicroscope，elec-trophoresisandtheimmunohistochemistrytechnology，istryoftheapoptosisonPC12cellsinducedbydopamineine（DA）inducedapoptosisinPC12cell

3、.Theearlyal-terationitochondrionandtheexpressionofbcl-2anti-apoptosisprotein.Thenthespecificnuclearultrastructureofapoptosisandthetypical　DNA“ladder”electrochromatographyaybeinvolvedinthepathogenesisofPD，andthemitochodriaplaysasignificantroleintheearlyapoptos

4、isofcells.　　0引言　　帕金森病的特征性病理改变为黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性死亡、缺失.其具体机制迄今尚不完全明确，目前认为PD患者脑内氧化应激反应过强，导致脑内神经递质多巴胺异常代谢产生过量的反应性氧自由基在其中起重要作用［1］.细胞凋亡是致病因子或异常信号诱导发生的“生理性”的主动细胞死亡过程.它可能参与了PD的发病过程［2，3］.PC12细胞株做为一种儿茶酚胺类细胞株，被广泛应用于神经细胞死亡方式及毒性损害研究.我们主要观察多巴胺（DA）诱导PC12细胞凋亡的早期超微结构变化，以探讨细胞凋亡

5、在PD的发病机制中的作用.　　1材料和方法　　1.1细胞培养PC12细胞株（购于中国科学院上海细胞生物研究所）置于RPMI-1640培养液中，内含200mL・L-1胎牛血清，谷氨酰胺2mmol・L-1，青霉素50ku・L-1，链霉素25mg・L-1，培养瓶中预先铺以200mg・L-1鼠尾胶，用于细胞传代，置于50mL・L-1CO2孵箱37℃培养，隔天换液.　　1.2药物处理待PC12细胞生长良好时加入多巴胺0.5mmol}

6、39;L-1，同时将部分细胞置于培养皿中，进行细胞爬片.空白对照组加入RPMI-1640培养液.分别培养12及24h.　　1.3形态学观察分别取0.5mmol・L-1多巴胺培养12h及24h的细胞片，福尔马林固定30min，0.01mmol・L-1PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，HE染色光镜下观察.　　1.4流式细胞仪检测分别取0.5mmol・L-1DA处理12及24h的细胞液经2.5g・L-1胰酶和2.0g・L-1EDTA液消化，制成细胞

7、悬液，调整细胞浓度1×109・L-1，离心后弃去上清液，重悬浮于5mL，4℃预冷的葡萄糖盐水中，按每1mL悬液加入2mL4℃冷乙醇的量固定24h，按1∶1加入碘化丙啶（PI）染色，4℃放置25min，流式细胞仪中进行分析.　　1.5免疫组织化学bcl┐2染色应用SABC试剂盒，将细胞片置于30mL・L-1H2O2中常温处理10min;蒸镏水洗涤3次;加入血清封闭液20min;加入bcl-2抗体37℃1h;0.01mmol・L-1PBS洗涤3次;加入生物素化二抗37℃20m

8、in;PBS洗涤3次;加入SABC试剂37℃20min;PBS洗涤4次;DAB显色;苏木素轻度复染，脱水封片镜检.　　1.6电镜检查分别将0.5mmol・L-1DA处理12及24h的细胞悬液离心后弃去上清，加入30mL・L-1戊二醛固定30min，送电镜室做超薄切片，JEM-2000EX型透射电镜下观察照相.　　1.7DNA凝胶电泳分别取0.5