多巴胺诱导pc12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析论文

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1、多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析论文.freelineAbstract:AIMTostudythemechanismofdopaminergicneuronaldeathofParkinson’sdiseases（PD）.METHODSUsingthefloetry，electronmicroscope，elec-trophoresisandtheimmunohistochemistrytechnology，istryoftheapoptosisonPC12cellsinducedbydopamin

2、eine（DA）inducedapoptosisinPC12cell.Theearlyal-terationitochondrionandtheexpressionofbcl-2anti-apoptosisprotein.ThenthespecificnuclearultrastructureofapoptosisandthetypicalDNA“ladder”electrochromatographyaybeinvolvedinthepathogenesisofPD，andthemitochodriaplaysasig

3、nificantroleintheearlyapoptosisofcells.0引言帕金森病的特征性病理改变为黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性死亡、缺失.其具体机制迄今尚不完全明确.freelLL-1胎牛血清，谷氨酰胺2mmolL-1，青霉素50kuL-1，链霉素25mgL-1，培养瓶中预先铺以200mgL-1鼠尾胶，用于细胞传代，置于50mLL-1CO2孵箱37℃培养，隔天换液.1.2药物处理待PC12细胞生长良好时加入多巴胺0.5mmolL-1，同时将部分细胞置于培养皿中，进行细胞爬片.空白对照组加入RPMI-164

4、0培养液.分别培养12及24h.1.3形态学观察分别取0.5mmolL-1多巴胺培养12h及24h的细胞片，福尔马林固定30min，0.01mmolL-1PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，HE染色光镜下观察.1.4流式细胞仪检测分别取0.5mmolL-1DA处理12及24h的细胞液经2.5gL-1胰酶和2.0gL-1EDTA液消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度1×109L-1，离心后弃去上清液，重悬浮于5mL，4℃预冷的葡萄糖盐水中，按每1mL悬液加入2mL4℃冷乙醇的量固定24h，按1∶1加入碘化丙啶（PI）染色，4℃

5、放置25min，流式细胞仪中进行分析.1.5免疫组织化学bcl┐2染色应用SABC试剂盒，将细胞片置于30mLL-1H2O2中常温处理10min;蒸镏水洗涤3次;加入血清封闭液20min;加入bcl-2抗体37℃1h;0.01mmolL-1PBS洗涤3次;加入生物素化二抗37℃20min;PBS洗涤3次;加入SABC试剂37℃20min;PBS洗涤4次;DAB显色;苏木素轻度复染，脱水封片镜检.1.6电镜检查分别将0.5mmolL-1DA处理12及24h的细胞悬液离心后弃去上清，加入30mLL-1戊二醛固定30min，送

6、电镜室做超薄切片，JEM-2000EX型透射电镜下观察照相.1.7DNA凝胶电泳分别取0.5mmolL-1DA处理12及24h的细胞液，调整细胞浓度5×109L-1，裂解液裂解，RNAase，蛋白酶K孵育，酚抽提，乙醇沉淀，每样品提取DNA10μg经琼脂糖凝胶行电泳分析.2结果2.1形态学观察0.5mmolL-1多巴胺作用12h细胞HE染色形态学无明显改变，可见核分裂相减少（1个/HP）.24h则呈典型凋亡形态学改变，可见凋亡小体.空白对照组细胞生长旺盛，核分裂相明显（6个/HP）.2.2流式细胞仪检测0.5mmolL-

7、1多巴胺作用PC12细胞12h时流式细胞仪检测未见凋亡峰，但同空白对照组比较“S”期细胞明显下降，由38.7%下降为16.1%，表明细胞增殖明显抑制.而0.5mmolL-1多巴胺作用PC12细胞24h时流式细胞仪检测可见典型亚二倍体凋亡峰（AP），凋亡率为47.6%（Fig1～4）.图1－图4略2.3免疫组化bcl┐2表达在0.5mmolL-1多巴胺作用的PC12细胞中，无论12h还是24h光镜下均可见部分细胞胞质呈棕黄色，有棕黄色颗粒（bcl-2阳性细胞），部分细胞胞质呈淡紫色（阴性细胞）.但12h表达阳性率明显高于2

8、4h，呈强阳性，以后逐渐下降.而空白对照组胞质均为淡紫色未见bcl-2表达，细胞生长旺盛（Fig5）.2.4电镜检查0.5mmolL-1DA作用PC12细胞12h时电镜下未见明显凋亡特征性核改变，细胞形态稍有变化，可见线粒体肿胀、嵴不明显及内质网扩张.而24h则可见典型核结构改变:即核浓缩及凋亡小体.空白对照组细胞及