phloretin对aβ2535诱导pc12细胞凋亡的影响及其机制

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1、Phloretin对Aβ2535诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制【摘要】目的:探讨Aβ25-35（βamyloid）诱导PC12细胞凋亡过程中氯通道阻断剂Phloretin的保护作用及其机制.方法:采用MTT比色,LDH（lactatedehydrogenase）活力检测、Hoechst33258染色和琼脂糖凝胶电泳比较正常对照组、Aβ25-35损伤组和Aβ25-35+Phloretin组的PC12细胞存活与凋亡；WesternBlot印迹检测3组的JNK,PJNK蛋白表达.结果:10mmol/LPhloretin可明显抑制Aβ25-35诱导的PC1

2、2细胞凋亡，提高细胞存活率，减少LDH释放，减少PC12细胞核固缩、碎裂，降低PJNK蛋白的表达(P<0.01).结论:小剂量氯通道阻断剂Phloretin对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡具有保护性抑制作用，其机制与下调JNK的磷酸化激活有关.【关键词】β淀粉样蛋白凋亡JNKphloretin　　0引言　　老年斑（SP）是老年性痴呆（又称阿尔茨海默病，AD）患者脑中主要的病理变化之一，β淀粉样蛋白(Aβ)又是AD患者脑组织老年斑中的主要成分［1］，Aβ的多种片段（Aβ1-40,Aβ1-42，Aβ25-35）在体内外均能引起神经细胞的凋亡.9凋亡

3、或程序性细胞死亡的一个标志性的形态学改变是细胞皱缩，也称为凋亡性容积减小（AVD）.容积敏感性外向整流性氯（VSORCL-）通道在AVD发生过程中发挥重要作用，阻断VSORCL-通道可以阻止AVD及其后的凋亡事件的发生［2］.小剂量的Phloretin可相对特异地阻断VSORCl-通道［3］.我们拟探讨Phloretin对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响及机制.　　1材料和方法　　1.1材料　　NGF诱导分化过的PC12细胞株（中科院上海细胞生物研究所）.Aβ25-35（Sigma公司）；Phloretin(Alexis公司)；兔抗鼠PJNK和SA

4、PK／JNK多克隆抗体(CellSignaling公司)；二抗羊抗兔IgGHRP,BA1054(博士德生物工程有限公司)；LDH测试盒(南京建成生物工程研究所)；Hoechst33258染料，细胞凋亡DNALadder抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所).　　1.2方法　　1.2.1细胞培养与分组将分化过的PC12细胞用DMEM高糖完全培养基(含100mL/L小牛血清,青霉素1×105U/L，链霉素1×105U/L），在37℃,50mL/LCO2饱和湿度的孵箱中培养，2～3d传代1次.9实验分组：（1）正常对照组,用正常培养液培养细胞；（2）Aβ25-35

5、损伤组，Aβ25-35浓度为40mmol/L；（3）Aβ25-35＋Phloretin保护剂组，Aβ25-35浓度均为40mmol/L，Phloretin浓度分别为3,5，10，15mmol/L.　　1.2.2MTT检测细胞活性细胞接种在96孔板，每孔的培养液均为200μL，干预24h后，每孔加5g/LMTT20μL，37℃，50mL/LCO2继续培养4h，然后小心吸弃上清液，每孔加DMSO150μL，振荡10min，混匀，测A490nm值.　　1.2.3LDH活力测定干预处理24h后，按照试剂盒说明书进行操作.　　1.2.4Hoechst染色六孔板培养细胞

6、24h后，吸弃培养液，PBS冲洗，40g/L的多聚甲醛固定4℃，10min，去固定液，PBS洗2遍，3min/次，Hoechst染色0.5mL,5min，将孔中的切片取出，置于载玻片上，滴1滴抗淬灭封片液，盖上洁净的盖玻片，尽量避免气泡，显微镜下观察并拍照.每组细胞随机选取5个视野，分别计数正常细胞数（胞膜完整,着均匀的蓝色），凋亡细胞数（核染亮蓝色,呈均匀的致密斑块或分叶状），镜下计数细胞凋亡率.相同实验重复5次取检测结果的平均值.9　　1.2.5琼脂糖凝胶电泳DNA抽提方法按试剂盒说明进行，加样后60V，电泳90～120min.　　1.2.6Wester

7、nBlot印迹以总JNK蛋白作对照，测定其活化形式PJNK的表达.六孔板培养的细胞，用Aβ25-35进行损伤干预,干预时间分成0,3，6h，观察蛋白表达量，从而确定蛋白表达时间.根据结果把细胞分成空白对照组、Aβ损伤组和Aβ25-35＋Phloretin保护剂组.将细胞在冰上去除培养液，PBS洗1次,每孔加入含PMSF的细胞裂解液50μL，冰上孵育30min，刮取细胞移入EP管中，4℃12000g离心5min，吸取上清转移入EP管-70℃保存.用细胞蛋白总浓度测定试剂盒测出每个蛋白标本的蛋白质浓度，加入Loadingbuffer.配胶，上样，电泳，半干转膜

8、，封闭，一抗孵育过夜，PBST洗膜，加二抗，摇床摇1