phloretin对aβ2535诱导pc12细

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1、Phloretin对Aβ2535诱导PC12细【摘要】目的:探讨Aβ25-35（βamyloid）诱导PC12细胞凋亡过程中氯通道阻断剂Phloretin的保护作用及其机制.方法:采用MTT比色,LDH（lactatedehydrogenase）活力检测、Hoechst33258染色和琼脂糖凝胶电泳比较正常对照组、Aβ25-35损伤组和Aβ25-35+Phloretin组的PC12细胞存活与凋亡；EM高糖完全培养基(含100mL/L小牛血清,青霉素1×105U/L，链霉素1×105U/L），在3

2、7℃,50mL/LCO2饱和湿度的孵箱中培养，2～3d传代1次.实验分组：（1）正常对照组,用正常培养液培养细胞；（2）Aβ25-35损伤组，Aβ25-35浓度为40mmol/L；（3）Aβ25-35＋Phloretin保护剂组，Aβ25-35浓度均为40mmol/L，Phloretin浓度分别为3,5，10，15mmol/L.　　1.2.2MTT检测细胞活性细胞接种在96孔板，每孔的培养液均为200μL，干预24h后，每孔加5g/LMTT20μL，37℃，50mL/LCO2继续培养4h，然后小心吸

3、弃上清液，每孔加DMSO150μL，振荡10min，混匀，测A490nm值.　　1.2.3LDH活力测定干预处理24h后，按照试剂盒说明书进行操作.　　1.2.4Hoechst染色六孔板培养细胞24h后，吸弃培养液，PBS冲洗，40g/L的多聚甲醛固定4℃，10min，去固定液，PBS洗2遍，3min/次，Hoechst染色0.5mL,5min，将孔中的切片取出，置于载玻片上，滴1滴抗淬灭封片液，盖上洁净的盖玻片，尽量避免气泡，显微镜下观察并拍照.每组细胞随机选取5个视野，分别计数正常细胞数（胞膜完

4、整,着均匀的蓝色），凋亡细胞数（核染亮蓝色,呈均匀的致密斑块或分叶状），镜下计数细胞凋亡率.相同实验重复5次取检测结果的平均值.　　1.2.5琼脂糖凝胶电泳DNA抽提方法按试剂盒说明进行，加样后60V，电泳90～120min.　　1.2.6SF的细胞裂解液50μL，冰上孵育30min，刮取细胞移入EP管中，4℃12000g离心5min，吸取上清转移入EP管-70℃保存.用细胞蛋白总浓度测定试剂盒测出每个蛋白标本的蛋白质浓度，加入Loadingbuffer.配胶，上样，电泳，半干转膜，封闭，一抗孵育过

5、夜，PBST洗膜，加二抗，摇床摇1h，PBST洗膜，加发光液发光，QuantityOne软件采集分析图像.　　统计学处理：实验数据以x±s表示，用Graphpadsoftmol/LPhloretin均有保护作用(图1)，与损伤组比较差异均有统计学意义（P<0.01），其中10mmol/LPhloretin的保护作用最好，确定其为保护浓度.　　2.2LDH活力测定对照组（329±19U/L）与Aβ25-35损伤组（433±41U/L）比较差异有统计学意义（P<0.01）；Aβ25-35损伤

6、组与Aβ25-35＋Phloretin保护剂组（354±34U/L）比较差异有统计学意义（P<0.01）；而对照组与Aβ25-35＋Phloretin保护剂组比较差异无统计学意义.　　2.3Hoechst染色结果对照组凋亡率为（5.4±2.4）%；Aβ25-35损伤组的凋亡率为（43.2±4.3）%，明显高于对照组（P<0.01）；Aβ25-35＋Phloretin10mmol/L保护剂组凋亡率为（17.9±3.5）%，明显低于损伤组（P<0.01，图2）.A:对照；B:损伤；C:

7、Aβ25-35＋Phloretin10μmol/L保护剂.箭头示凋亡细胞.　　2.4琼脂糖凝胶电泳Aβ25-35损伤组可见明显的DNA“梯带”，对照组和保护剂组无DNA“梯带”（图3）.　　2.5APK）信号通路在神经元凋亡过程中扮演重要角色，特别是凋亡信号调节激酶1（ASK1），它属于MAPKKK家族成员，通过直接磷酸化MAPKKs激活JNK和p38通路.在氧化应激、TNF、内质网应激及Aβ诱导神经元凋亡过程中，ASK1是重要的信号激酶.氯通道阻滞剂SITS或细胞内低氯水平能明显下调Jurkat

8、T细胞的JNK信号转导，从而抑制细胞色素C释放和细胞凋亡，表明JNKMAPK途径介导氯通道阻断剂的凋亡保护性抑制作用［9］.　　综上所述，小剂量氯通道阻断剂Phloretin通过下调PJNK信号转导，实现有效地抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡，进一步支持VSORCl-通道激活是调控细胞凋亡重要的离子机制之一.【