phloretin对aβ2535诱导pc12细胞凋亡的影响及其机制

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1、Phloretin对Aβ2535诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制【摘要】目的:探讨Aβ25-35（βamyloid）诱导PC12细胞凋亡过程中氯通道阻断剂Phloretin的保护作用及其机制.方法:采用MTT比色,LDH（lactatedehydrogenase）活力检测、Hoechst33258染色和琼脂糖凝胶电泳比较正常对照组、Aβ25-35损伤组和Aβ25-35+Phloretin组的PC12细胞存活与凋亡；EM高糖完全培养基(含100mL/L小牛血清,青霉素1×105U/L，链霉素1×105U/L），在37℃,50mL/LCO2饱和湿度的孵箱中培养，2～

2、3d传代1次.实验分组：（1）正常对照组,用正常培养液培养细胞；（2）Aβ25-35损伤组，Aβ25-35浓度为40mmol/L；（3）Aβ25-35＋Phloretin保护剂组，Aβ25-35浓度均为40mmol/L，Phloretin浓度分别为3,5，10，15mmol/L.　　1.2.2MTT检测细胞活性细胞接种在96孔板，每孔的培养液均为200μL，干预24h后，每孔加5g/LMTT20μL，37℃，50mL/LCO2继续培养4h，然后小心吸弃上清液，每孔加DMSO150μL，振荡10min，混匀，测A490nm值.　　1.2.3LDH活力测定干预处理24h后

3、，按照试剂盒说明书进行操作.　　1.2.4Hoechst染色六孔板培养细胞24h后，吸弃培养液，PBS冲洗，40g/L的多聚甲醛固定4℃，10min，去固定液，PBS洗2遍，3min/次，Hoechst染色0.5mL,5min，将孔中的切片取出，置于载玻片上，滴1滴抗淬灭封片液，盖上洁净的盖玻片，尽量避免气泡，显微镜下观察并拍照.每组细胞随机选取5个视野，分别计数正常细胞数（胞膜完整,着均匀的蓝色），凋亡细胞数（核染亮蓝色,呈均匀的致密斑块或分叶状），镜下计数细胞凋亡率.相同实验重复5次取检测结果的平均值.　　1.2.5琼脂糖凝胶电泳DNA抽提方法按试剂盒说明进行，加

4、样后60V，电泳90～120min.　　1.2.6SF的细胞裂解液50μL，冰上孵育30min，刮取细胞移入EP管中，4℃12000g离心5min，吸取上清转移入EP管-70℃保存.用细胞蛋白总浓度测定试剂盒测出每个蛋白标本的蛋白质浓度，加入Loadingbuffer.配胶，上样，电泳，半干转膜，封闭，一抗孵育过夜，PBST洗膜，加二抗，摇床摇1h，PBST洗膜，加发光液发光，QuantityOne软件采集分析图像.　　统计学处理：实验数据以x±s表示，用Graphpadsoftmol/LPhloretin均有保护作用(图1)，与损伤组比较差异均有统计学意义（P<

5、;0.01），其中10mmol/LPhloretin的保护作用最好，确定其为保护浓度.　　2.2LDH活力测定对照组（329±19U/L）与Aβ25-35损伤组（433±41U/L）比较差异有统计学意义（P<0.01）；Aβ25-35损伤组与Aβ25-35＋Phloretin保护剂组（354±34U/L）比较差异有统计学意义（P<0.01）；而对照组与Aβ25-35＋Phloretin保护剂组比较差异无统计学意义.　　2.3Hoechst染色结果对照组凋亡率为（5.4±2.4）%；Aβ25-35损伤组的凋亡率为（43.2±4.3）%，明显高于对照组（P&l

6、t;0.01）；Aβ25-35＋Phloretin10mmol/L保护剂组凋亡率为（17.9±3.5）%，明显低于损伤组（P<0.01，图2）.A:对照；B:损伤；C:Aβ25-35＋Phloretin10μmol/L保护剂.箭头示凋亡细胞.　　2.4琼脂糖凝胶电泳Aβ25-35损伤组可见明显的DNA“梯带”，对照组和保护剂组无DNA“梯带”（图3）.　　2.5ol/L与Aβ25-35损伤组比较差异有统计学意义（P<0.01，图4，5）.　　等张力性细胞皱缩是细胞凋亡形态学改变的主要标志.凋亡早期发生的张力正常的细胞皱缩被称为AVD.AVD是细胞凋亡生物化

7、学事件的上游调控机制［6］.目前认为与AVD发生有关的离子机制主要是细胞膜容积调节性钾通道和氯通道的开放，促使细胞内的K+和Cl-外流，导致细胞容积缩小.多种氯通道阻断剂（DIDS，NPPB，SITS，NFA等）在不同细胞上均显现对凋亡的保护性抑制作用，而且推测VSORCl-通道参与了AVD过程［6-8］.研究发现，小剂量的Phloretin（<100mmol/L）能选择性阻断VSORCl-通道［3］.于是，我们研究了小剂量Phloretin（10μmol/L）在Aβ诱导PC12细胞凋亡中的作用.结果显示，在细胞存活、细胞损伤、以及细胞凋亡的多