环孢素a减轻β淀粉样蛋白25-35诱导pc12细胞损伤的实验研究

《环孢素a减轻β淀粉样蛋白25-35诱导pc12细胞损伤的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河北医科大学硕士学位论文环孢素A减轻β淀粉样蛋白25--35诱导PC12细胞损伤的实验研究姓名：强静申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：王铭雅201203中文摘要环孢素A减轻13淀粉样蛋白25-35诱导PCI2细胞损伤的实验研究摘要目的：阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是老龄人群中最常见的中枢神经系统退行性疾病，严重损害患者的认知功能。随着社会人口老龄化的不断加剧，AD的防治已经成为一个严峻的社会问题。目前，对于AD尚没有理想的治疗方法，寻求有效的治疗药物成为研究者的努力方向

2、之一。大量研究表明，p．淀粉样蛋白(Amyloid-13，A[3)在脑实质内的聚集和沉积是导致患者脑内神经元变性、丢失乃至形成痴呆的关键因素。因此，很多研究致力于开发干扰Ap合成和沉积的药物类型。目前，通过提高自噬(Autophagy)活性促进A8清除的方法逐渐成为研究热点。自噬是溶酶体对受损细胞器和老化、毒性蛋白进行吞噬降解的一种主动清除方式，对维持细胞内环境稳定和行使正常生理功能起着积极的作用。+有研究发现，在AD患者及动物模型中，存在自噬水平的降低，可能与AD的发病有关。适度提高白噬溶酶体途径(aut

3、ophagic-lysosomalsystem，ALP)的活性，可以加速有聚集倾向的蛋白的降解，有可能对A13等蛋白沉积引起的神经退行性疾病如AD起到治疗作用。很多研究表明环孢素A(CyclosporinA，CsA)具有神经保护作用，而且近期有文献报道CsA能够在大鼠脑细胞中诱导自噬，但是尚未见报道CsA对AD有无保护作用，对自噬水平有何影响。我们利用A1325．35干预PCI2细胞24h建立AD的体外细胞模型，观察不同浓度CsA对受损PCI2细胞的活力及代谢状态、存活率以及形态学的影响，并观察CsA对受损

4、PCI2细胞的保护作用是否与自噬通路相关。方法：(1)PCI2细胞株使用含10％胎牛血清、5％马血清、100ng／L链霉素、O．1肌青霉素的高糖DMEM培养基，于37℃、5％C02的培养箱中培养。(2)分别给予0lXM、10IXM、20laM、30IXM的A1325．35干预PCI2细胞24h后，MTT法检测各组细胞活力，以判断不同浓度AB25．35对PCI2细胞的损伤程度，并选取适合浓度(20laM)的AB25．35干预PCI2细胞，建立AD的体外细胞模型。使用O．1uM、O．5uM、1．0uM、1．5u

5、M、2．0IXM环孢素A(CsA)对PCI2细胞预处理24h后，给中文摘要予20uM的A1325．35继续培养24h。MTT法检测细胞活力及代谢状态，从中选取CsA的有效保护剂量(O．5uM)用于后续实验。将细胞分为正常对照组、模型组、O．5uMCsA预处理组，分别进行如下实验：①光镜下观察各组PCI2细胞形态学变化。②Hoechst33258／碘化丙啶(propidiumiodide，PI)双染法检测各组细胞的存活率。③免疫荧光染色法检测细胞LC3的表达，观察自噬活性的变化。结果：(1)AD模型的建立：给

6、予PCI2细胞不同剂量AB25．35处理后进行MTT检测，结果显示AB25．35对PCI2细胞具有损伤作用，且呈剂量依赖性。其中，20uMA13和30uMA13组与对照组相比，光密度值具有统计学差异(P=-0．000；P=O．ooo)，本实验选择20uMA13对PCI2细胞处理作为AD的体外细胞模型。(2)CsA有效剂量的选择：给予各组PCI2细胞相应处理后，使用酶标仪检测570nm处的光密度值。模型组细胞光密度值较空白组明显降低(P<0．001)，与前实验结果相符；O．5uMCsA预处理的PCI2细胞光密

7、度值与AB25．35处理组相比明显增高(PO．05)。因此，选取O．5uMCsA预处理PCI2细胞用于后续实验。(3)CsA对AB25．35损伤PCI2细胞形态的影响：正常对照组的PCI2细胞生长状态良好，胞体饱满、明亮，突起伸展充分，贴壁良好。模型组细胞状态明显变差，胞体变暗，突起短小，视野内可见大量脱落的细胞碎片。而O．5pMCsA预处理组的PCI2细胞状态与单纯A13组相比有明显

8、改善，贴壁良好，突起较长，细胞形态较完整，细胞碎片少见。(4)CsA对AD模型细胞存活率的影响：空白对照组细胞存活率最高，20uMA1325．35处理组细胞存活率较对照组明显降低，结果有统计学差异(卢O．007)；O．5uMCsA预处理的PCI2细胞存活率较单纯A13组有明显改善，具有统计学差异(P=O．012)。(5)CsA对模型组细胞自噬活性的影响：对照组PCI2细胞LC3荧光较强，范围涵盖胞核以外的整个胞体