原花青素对aβ2535诱导pc12细胞周期紊乱的保护作用

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1、原花青素对Aβ2535诱导PC12细胞周期紊乱的保护作用：谢朝阳梅寒芳祝其锋吴斌华陈小芳【摘要】目的观察原花青素(PAC)对β淀粉样肽(2535)（Aβ2535）诱导体外血清饥饿培养的PC12细胞周期紊乱与凋亡的保护作用，并探讨其可能的作用机制。方法采用血清饥饿培养使PC12细胞同步于G0期，PAC预处理后加入Aβ2535，通过流式细胞仪分析细胞周期与凋亡，RTPCR和ethodsPC12cellsdeprivation,pretreatedetry.ProteinandmRNAexpressionsofp21，CyclinD1，pR

2、bandE2F1arkably(P＜0.05)inPACgroup,themRNAandproteinexpressionsofp21genedeprivedPC12cellsinducedbyAβ25～35,er′sdisease，AD)是一种老年神经系统退行性疾病，病因十分复杂。近年研究表明AD病理变化可能与细胞周期调控紊乱有关。本课题组的研究也表明，β淀粉样肽（Aβ）2535诱导血清饥饿培养PC12细胞周期紊乱、凋亡，伴有细胞周期相关蛋白表达异常〔5〕，而PAC可剂量依赖性对抗Aβ2535对PC12细胞的毒性作用，增加PC12细胞的存

3、活率〔6〕。本实验以已建立的Aβ2535诱导血清饥饿培养PC12细胞为受损神经元模型，进一步研究PAC对受损神经元的保护作用是否与细胞周期调控有关。1材料与方法1.1材料PC12细胞由军事医学科学院基础医学研究所马子敏博士惠赠；Aβ2535购于Sigma公司（用PBS配制）；DMEM及马血清均购自Gibco公司；P21、CyclinD1小鼠抗大鼠单克隆抗体、pRb(Ser780)兔抗大鼠多克隆抗体、ECL试剂为SantaCruz公司产品；RTPCR试剂盒为大连宝生物工程公司产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；琼脂糖为Amresco公司产品；

4、各种规格培养皿均为美国CorningCostar公司产品；引物为上海生物工程公司合成。PAC购自南京学子医化研发中心，为葡萄籽提取物，质量分数大于95%，用DMSO溶解配成贮存液，DMSO终浓度＜0.1%(V/V)；其余试剂为国产分析纯。1.2方法1.2.1细胞培养方法见参考文献〔5〕。1.2.2血清饥饿法处理PC12细胞将对数期生长的PC12细胞以各实验所需细胞数接种于培养板或培养瓶中，24h贴壁后，按常用的血清饥饿法，使细胞同步化于G0期。即：吸出原培养液，用DHanks液洗2次，换成无血清DMEM孵育24h，使细胞静止于G0/G1期。按照

5、下述方法进行实验。1.2.3药物处理及分组取同步化PC12细胞，用终浓度30mg/L的PAC预处理1h，再加25μmol/LAβ2535，继续培养至所需时间，收集细胞进行实验。每次实验均分空白对照组(0μmol/LAβ2535)、Aβ2535诱导组及药物保护组(PAC+Aβ2535)。1.2.4流式细胞术检测取对数生长期的PC12细胞以3×108个/L接种于6孔板，每孔加2ml培养，药物保护组加入终浓度为30mg/LPAC预处理1h，再与诱导组同时加入终浓度为25μmol/LAβ2535，继续培养24h，收集细胞至1.5mlEP管中，P

6、BS洗2次，800r/min离心10min，70%乙醇-20℃固定过夜，用PBS洗1次，1200r/min离心10min，每管加PI至终浓度为50mg/L，37℃避光孵育30min，过滤后上机检测。每个样品计数10000个细胞，每组重复3次取平均值。1.2.5RTPCR检测p21、CyclinD1、E2F1基因mRNA表达将对数期生长的PC12细胞以2×108个/L接种于6孔板，每孔加2ml培养24h，加入30mg/L的PAC预处理1h，再加25μmol/LAβ2535，继续培养4、8、20h，按Trizol试剂盒说明抽提总RNA。引物序列：

7、①鼠p21SF，2μg/mlAprotinin，0.5μg/mlLeupeptin)，提取蛋白。蛋白定量采用Bradford法，12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿电转移法转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭1h，加入用封闭液稀释的一抗p21、CyclinD1（1∶200）、pRb和βactin（1∶400），室温结合2h，洗膜后加入适量二抗稀释液(P21、CyclinD1、βactin1∶5000；pRb1∶8000)，反应1.5h。化学发光法显色，X射线胶片曝光，扫描保存。用Bandscan图像分析软件进行光密度积分值分析，计算目

8、的蛋白与βactin(内参照)的光密度积分值之比作为各目的基因蛋白的相对含量值。1.3统计学处理采用SPSS10.0统计软件包完成。实