多巴胺诱导pc12细胞凋亡的实验研究

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1、第四军医大学硕士学位论文嗜铬细胞瘤PCI2细胞帕金森病多巴胺凋亡氧自由基超微结构免疫组织化学Bcl-2家族抗氧化剂谷胱甘肽N一乙酰半胱氨酸中英文对照关键词PheochromocytomaPCI2cel1ParkiNSON’Sdisease(PD)Dopamine(DA)ApoptosisOxygenfreeradicalU1trastructureImmunohistochemistryBel-2familyAntiOXidantSGlutathioneN——acetyl——cysteine第四军医大学硕士学位论文多巴胺诱导PO

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3、细胞凋亡的实验研究研究生导师李立宏高国栋中文摘要帕金森病(Parkinsondisease，PD)是一种中老年常见的中枢神经系统变性疾病／其特征性病理改变为：中脑黑质多巴胺能神经元进行性死亡、缺失，导致内源性神经递质多巴胺(Dopamine，DA)含量减少，出现震颤、僵直及运动迟缓等一系列临床症状。关于其神经元死亡机制目前尚未完全明确，但形态学研究表明PD患者多巴胺能神经元呈凋亡样改变，提示细胞凋亡可能参与了PD的发病过程。而大鼠嗜铬细胞瘤PCI2细胞作为一种儿茶酚胺类细胞株，被广泛应用于神经元的死亡方式及毒性损害的研究。，k，?目

4、的：，(目前PD的临床药物治疗主要是左旋多巴(L-dopa)类药物替代疗法，通过补充外源性DA来弥补脑内多巴胺的不足，缓解临床症状。但长期服用患者则会出现明显的药物依赖性及副反应。表现为随着时间的延长，药物剂量逐渐增加疗效逐渐降低直至无效，病情缓慢发展一段时间后明显加重，并出现开一关波动、异动症等副反应。最新研究表明DA其凋亡发生之间的相互关系，以及应用各种抗氧化剂观察对PCI2细胞第四军医大学硕士学位论文的保护作用，探讨PD神经元的死亡方式及发病机制。并借助免疫组织化学、流式细胞仪、电镜及电泳等技术进一步深入研究DA在不同时期对P

5、CI2细胞的周期变化、超微结构变化及生化改变的影响，探讨PD在不同时期内细胞结构与功能变化之间的相互关系，为PD的临床治疗提供相应的理论依据。厂f方法{1、应用流式细胞仪技术观察不同浓度DA在不同作用时间内对PCI2细胞的影响，了解细胞死亡方式，观察细胞周期变化及凋亡发生同剂量与时间的相互关系。2、应用电镜及电泳技术观察不同浓度DA在不同作用时间内对PCI2细胞超微结构及生化改变的影响，进一步明确细胞死亡方式及病变发展的病理过程，探讨细胞凋亡信号传导中的胞浆及胞核变化。3、应用免疫组织化学技术观察DA诱导PCI2细胞凋亡时的免疫应答

6、：抗凋亡基因和促凋亡基因之间在凋亡的不同阶段的表达率的变化，及其同凋亡发生之间的相互关系，明确凋亡发生中的关键环节。进一步探讨胞浆特别是线粒体在凋亡发生中的作用，并分析其信号传导过程。4、观察各种抗氧化剂对DA诱导PCI2细胞凋亡的不同保护作用，结合其分子结构及功能特点，探讨氧自由基在PD发病中的重要作用，并为临床治疗提供理论依据。结果1．DA可诱导PCI2细胞发生凋亡，且这种作用呈一定的剂量及时间的依赖性。在低浓度及作用时间较短时表现为对PCI2细胞的生长抑制，此时观察细胞周期变化可见“S”期细胞明显抑制，G2／GI比值上升。而在

7、高浓度及作用时间较长时，细胞呈凋亡样改变，且凋亡率在一定范围内同浓度成正比，此时流式细胞仪可见典型DNA亚二倍体凋亡峰(AP)。2．DA作用PCI2细胞12h时电镜下未见明显凋亡特征性核结构改变，但第四军医大学硕士学位论文可见线粒体肿胀、嵴不明显、消失，内质网扩张、空泡化，细胞结构基本正常。此时电泳分析未见异常改变。当作用24h时电镜下部分细胞呈凋亡样改变：核浓缩、染色体聚积在核膜的周围、胞浆浓缩、空泡化等。此时电泳可见典型DNA阶梯样降解片段。当作用浓度或时间进一步延长时，则电镜下呈坏死样改变。3．DA作用PCI2细胞3h即出现原

8、癌基因Bcl一2及Bax的表达，其中Bcl一2具有抗凋亡作用，在12h达到最高峰，以后迅速下降至48h时表达量几乎为零；而Bax为促凋亡蛋白，在6h时表达量最高，以后缓慢下降。4．应用四种不同的抗氧化剂GSH，N—AC，VC及VE．其中适当浓度(10mmol／L)的GSH及N—AC对DA诱导的细胞凋亡具有一定的保护作用，而VC及VE则几乎无保护作用。，斗～』结论1．本实验证实了多巴胺对PCI2细胞具有明显杀伤作用，且这种损伤方式为细胞凋亡。／而多巴胺的异常代谢产生的过量氧自由基可能是细胞凋亡的主要原因，为帕金森病的发病机制提供了一定

9、的理论依据3、2．本实验首次在超微结构上分析了PCI2细胞在DA作用不同时间下的超微变化，揭示了线粒体在细胞凋亡中的重要作用。3．本实验观察了细胞在多巴胺诱导凋亡的不同时间下的免疫应答，提出抗凋亡蛋白Bcl-2同促凋亡蛋白Bax的比值