氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

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1、氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响【关键词】氨基胍骨关节炎软骨细胞凋亡兔诱导型一氧化氮合酶　　ABSTRACT:ObjectiveToobservetheeffectofaminoguanidinebyintraperitonealinjectiononapoptosisofchondrocyte.Boththeexperimentandthemodelgroupsb,ent.Theexperimentgroupsinoguanidineinabdominalcavity,100mg/(kg·d),andthecontrolgr

2、oupsevoluminalnormalsalineinabdominalcavity.Atthe4ththenormalgroup,and6fromthecontrolgroupandtheexperimentgroup,respectively.Atthe8thaterialsfromeachsampleforpathologicalobservationontheicroscopebyHEandimmunohistochemicalstaining,andcountedapoptosiscellsbyTUNELforstat

3、isticalanalysis.ResultsparedentgrouporesimilartothenormalgroupingeneralobservationandopticalmicroscopeobservationbyHEstaining.BothiNOSpositiveexpressioncellbyimmunohistochemicalstainingandapoptosiscellcalculationbyTUNELoftheexperimentgroupinoguanidineinjectedinabdomin

4、alcavitycandepresstheproductionofiNOS,decreaseapoptosisofthecartilagecell,anddelayorpreventprogressionofOA.　　KEYinoguanidine;osteoarthritis;chondrocyte;apoptosis;rabbit;iNOS　　骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种老年常见慢性疾病，严重影响患者的生活质量，其重要的病理学特征是关节软骨的降解(包括软骨细胞的数量减少和细胞外基质降解)。早期缺乏有效

5、的特异性治疗方法，往往因症状加重而需行人工关节置换术。现研究证明，OA患者体内一氧化氮(nitricoxide,NO)浓度升高。过高的NO可影响关节软骨的代谢，造成软骨细胞凋亡增多。氨基胍(aminoguanidine,AG)是一种选择性的诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)抑制剂，本实验使用AG干预兔OA模型，观察关节软骨的形态变化及软骨细胞凋亡，旨在探讨治疗OA的新途径。　　1材料与方法　　1.1材料健康成熟日本大耳白兔32只，体重2.2-2.5kg，由西安交通大学医学院实验

6、动物中心提供。氨基胍硫酸盐由美国Sigma公司购得，iNOS免疫组化染色一抗购自博士德生物工程有限公司，二抗及碱性磷酸酶购自北京鼎国生物技术公司，原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)购自美国罗氏公司。　　1.2实验分组32只兔子随机分为正常组、模型组和氨基胍组。后两组行右后肢伸直位管型石膏固定造模,自由活动，正常喂养。氨基胍组腹腔内注射氨基胍硫酸盐溶液100mg/(kg·d)，模型组每天腹腔内注射相同体积的生理盐水，正常组不予任何处理。密切观察动物，有石膏松动迹象时，予以修复，牢靠固定。　　1.3形态观察及HE染色4、8周时采用

7、空气栓塞法分别处死各组半数动物，取右后肢股骨髁进行大体标本病理学观察后，用40g/L多聚甲醛固定，100g/LEDTA脱钙液脱钙，制备切片，HE染色。　　1.4TUNEL法检测细胞凋亡切片二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，30mL/L过氧化氢处理10min，用蛋白酶K于37℃消化15min，滴加25μL的TUNEL反应混合溶液(含末端脱氧核糖核酸转移酶TDT及含有核苷酸混合液)，在湿盒中37℃孵育60min，DAB显色，苏木素复染，封片。阳性对照：在切片置TUNEL反应混合溶液前，先在200ng/mLDNaseⅠ(DNA聚合酶Ⅰ)溶液

8、中37℃下反应15min；阴性对照标记时不加TDT，其余步骤相同。　　1.5iNOS的免疫组化染色切片二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，30mL/L过氧化氢甲醇冲洗，磷酸盐缓冲液冲洗，1.25g/L胰蛋白酶消化。加入10mL/L牛血清白蛋白，20℃孵育