no对软骨终板细胞代谢及细胞凋亡的影响

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1、546以科学发展观健进科技创新(上)NO对软骨终板细胞代谢及细胞凋亡的影响刘斌蔡道章广东省广州市天河路600号，中山大学附属第三医院骨科，510630摘要目的：通过建立猪腰椎问盘软骨终板细胞的培养模型，并施加NO，探讨NO对软骨终板细胞代谢及凋亡的影响。方法：取长枫杂交猪腰椎间盘软骨终板细胞，于20％胎牛血清的DMEM培养基中培养，建立体外软骨终板细胞培养模型，以光镜及HE染色观察其生物学表现，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色对软骨终板细胞进行鉴定；以2mm01]L硝普钠(SNP)处理软骨终板细胞，”S和3H一脯氨酸掺入法检测蛋白多糖及胶原的合成．放射

2、性免疫测定法刹炎性细胞因子的生成，碘化丙啶(PI)荧光染色观察软骨终板细胞凋亡。结果：原代细胞生物学性收最接近体内细胞，；次传代后细胞呈现衰老现象。经染色证实此细胞具有Ⅱ型肢原表达。施加SNP后，软骨终板细胞蛋白多糖及胶原合成明显减少(P<0．01)，炎性细胞因子含量明显升高(P<001)，细胞凋亡率显著增高(P<0．01)。结论：NO抑制软骨终板细胞蛋白多糖及胶原合成．促进炎性细胞因子厦细胞凋亡增加。关键词外科学一氧化氮软骨终板细胞细胞凋亡腰椎间盘蜕变为引起腰腿痛的主要原因，其确切的发生机理迄今仍不十分清楚，但有越来越多的证据表明软骨终板蜕变

3、与椎问盘蜕变密切相关。一氧化氮(Nitricoxide，NO)是一种广泛存在于生物体内的小分子生理介质，由L一精氨酸经一氧化氮合酶(NOS)催化生成。对于NO在退行性骨关节病中的作用机制，国内外已有许多报道，但NO在腰椎间盘退变中的作用报道不多，特别是NO与软骨终板蜕变的关系还不清楚。本文通过对软骨终板细胞施加NO，探讨NO对软骨终板细胞代谢及凋亡的影响。一、材料和方法(一)软骨终板细胞的培养8只长枫杂交猪，雄性，体重18～20kg，静脉注射2％戊巴比妥钠1．5ml，／kg麻醉。备皮后，碘伏消毒皮肤，铺无菌手术巾。俯卧位，取背部正中切口．剥离椎

4、旁肌，显露全部6节腰椎，锯下腰椎，放人无菌取材盒内，转移至超净台。切开椎间盘，刮除髓核并削除纤维环，显露软骨终板。用10#刀片小心削取软骨终板，放入盛有无血清DMEM培养基的小青瓶内，清除表面血污和其他附着组织。用含有青霉素／链霉素双抗液的D—Hank’s液冲洗3次后，用小剪刀干剪软骨终板至1mm3大小的碎块，加入025％胰蛋白酶5mL，移至离心管中。37℃微型磁力棒搅拌消化30rain，低速离心(800r／rain)5rain，弃上清液，用D—Hank’S液冲洗2次，弃去D—Hank’S液。将软骨终板置于5mL02％的Ⅱ型胶原酶中，37℃震荡

5、消化4h，每2h收集一次细胞，200目不锈钢滤网过滤，离心管收集并低速离心(800drain)5min，弃上清液，无血清DMEM培养基清洗2次，收集细胞。残渣继续置人02％的Ⅱ型胶原酶中消化。待全部细胞收集后，将细胞均匀接种于培养瓶中。在37C5％C02的培养箱中培养，培养基为DMEM加20％肚科学发展观促进科技创新(三)547的胎牛血清，每3天换液1次，按时用倒置显微镜观察、拍照。细胞融合为单层时用025％胰蛋白酶消化并进行细胞传代o(二)HE染色将第二代细胞制成细胞爬片，待细胞达到80％～90％融合时，将细胞爬片取出，用甲醇与冰醋酸(体积比

6、3：1)的固定液中固定lOmin，进行常规HE染色，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜观察细胞形态。(三)Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色取出第三代细胞爬片，纯丙酮固定30min，蒸馏水洗，纯甲醇加H：02至0．5％，塞温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次。滴加正常山羊血清封闭液，室温封闭20min。甩去多余液体，不洗。滴加1：200稀释的Ⅱ型胶原抗体，4℃孵育过夜。0．01MPBS洗2min×3次。滴加生物素化二抗，室温孵育20min，0．01MPBS洗2rain×3次。滴加SABC试剂，室温20rain，0．01MPBS洗5min×4

7、次。DAB显色剂显色。冲洗．封片。以成纤维细胞为阴性对照。(四)”S掺入法检测蛋白多糖合成软骨终板细胞接种于96孔培养板，加人含5％FBS的DMEM培养基29t3j，tL，船人硝普铺终浓度为2mmollL，对照组不加硝普钠，每组复设6孔。培养24h后，每孔加入5tuCi／mLNa2”SO,培养12h，加入10％三氯乙酸固定10rain，然后每孔加入含1％SDS的0．3MNaOH300p,L．裂解细胞．吸取液体于闪烁杯中，再加人阕烁液2mL，混匀，于LS一6500闪烁计数仪计数。结果以cpm表示。(五)3H一脯氨酸掺入法检测胶原合成将2mmol／

8、L硝普钠加入96孔培养板的软骨终板细胞，对照组不加硝普钠，培养24h后，每孔加入lvCi／mL3H一脯氨酸培养24h。收集培养液，依次加入5mol／L