单味中药骨碎补对兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡作用的实验研究

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1、辽宁中医药大学博士学位论文单味中药骨碎补对兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡作用的实验研究姓名：金连峰申请学位级别：博士专业：中西医结合临床指导教师：刘元禄20090401辽宁中医药大学2006届博士学位论文摘要目的：骨关节炎(osteoarthritis，OA)，是由于多种因素引起的多发于老年人的慢性退行性关节疾病，60岁以上的人群中，50％人群在X线上有骨性关节炎表现，其中35％-50％有临床表现；75岁以上的人群中，80％有骨性关节炎症状。随着人口老龄化的进展，骨关节炎的发病率逐年上升，发病年龄也有下降趋势，有资

2、料报道45岁以上人群骨关节炎的发病率超过40％。随着我国步入老龄化人口社会，骨关节炎正日渐成为医患共同关注的焦点，为此世界卫生组织(WHO)将lO月12日定为“世界骨关节炎日"，21世纪头十年为“骨关节病十年"。骨性关节炎是膝关节炎症中最常见的疾病。膝骨性关节炎在老年人群中最为常见，尤其是在肥胖的老年人群。男女均可发病，女性多于男性。临床观察证实，膝骨性关节炎患者已普遍扩展到35岁以上人群，严重困扰着人们的日常生活与劳动。骨性关节炎是一种以关节软骨变性和丢失及关节边缘和软骨下骨骨质再生为特征的慢性关节炎疾病。

3、该病的始发部位在软骨。骨关节炎的病因和发病机制尚不完全清楚，一般认为既有年龄、性别、家族易感性等全身因素的参与，又有局部生物力学、软骨细胞凋亡、细胞因子和降解酶等的作用，是多因素、多环节导致的疾病。有文献报道，软骨细胞凋亡可能是oA发病机制中的重要环节。目前，软骨细胞凋亡信号的诱导途径(Fax、NO)，调控软骨细胞凋亡的信号因子(Bcl-2家族，caspases蛋白酶)，软骨细胞凋亡的刺激信号等指标是实验研究中的热点。大量研究也证实，oA病程中自介素1(IL-I)、肿瘤坏死因子一Q(TNF-Q)、基质金属蛋白

4、酶系(MMPs)[尤其是删P一1、砌IP-3、MMP-13和金属蛋白酶组织抑制剂一1(TIMP-I)]等显著变化。通过这些指标的测定可以间接了解oA的演进过程，推测它们在oA发病机制中对软骨细胞凋亡所起的作用，还有是用于评价0A干预措施的作用靶点与机理。骨关节炎在中医学中属于“痹病"，“骨痹"范畴，肝肾不足，筋骨失养是重要发病机制。骨碎补性味苦、温，活血续伤，补肾强骨，为骨伤科要药，具有一定的改善软骨细胞功能，推迟软骨细胞退行性变的作用。本实验主要利用细胞、分子生物学技术，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR

5、)、蛋白印迹(Western—blot)等检测方法，通过软骨细胞凋亡相关因子的不同表达，进一步探讨oA发病机制，研究骨碎补作用机理，观察其对实验性兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡单味中药骨碎补对兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡作用的实验研究的影响，并进行了理论分析，为中医药防治膝骨性关节炎的实验与临床提供理论与实际应用的依据。材料与方法：1、实验动物成年新西兰大耳白兔24只，普通级，雌雄不分，重量2-3kg。辽宁中医药大学动物实验中心提供。2、实验药物2．1骨碎补辽宁中医药大学附属医院药剂科提供。水煎浓缩成含生药浓度lg／

6、ml的药液备用，共计630mi。2．2维固力爱尔兰RottapharmLtd，批号：H20040637，规格：0．259(以硫酸氨基葡萄糖计)，辽宁中医药大学附属医院药剂科提供。3、实验主要试剂(1)WesternBlot检测用I抗抗体：鼠抗兔单克隆抗体IL一1、羊抗兔TNF—Q、鼠抗兔MMP3、鼠抗兔Bcl一2、羊抗兔BAX、鼠抗兔Caspase一3、羊抗兔B—actin(美国santacruzbiotechnology，@inc．)。II抗抗体：碱性磷酸酶标记兔抗鼠、兔抗羊抗体(北京中山生物技术有限公司)

7、。(2)内源性过氧化物酶阻断剂：3％过氧化氢溶液(3)封闭用正常小牛血清白蛋白工作液(4)碱性磷酸酶标记的II抗工作液(5)浓缩PBS缓冲溶液(6)3，3一氨基联苯胺四盐酸盐(3，3-Diaminobenxidinetetrahydroehloride，DAB)(2)一(6)福州迈新生物技术开发公司(7)总RNA提取试剂异硫氰酸胍(TriozolReagent)：美国InvitrogenLifetechnologies公司(8)反转录酶(AMY)(9)RNA酶抑制剂(10)dNTP混合液(11)Oligo(d

8、T)15(12)Y—TaqDNA聚合酶辽宁中医药大学2006届博士学位论文(13)目的基因引物(8)一(13)日本TaKaRa公司(14)琼脂糖：美国Promaga公司(15)考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒：南京建成生物工程公司(16)硝酸纤维素膜：购自Millopore公司(17)其他试剂：6×凝胶上样缓冲液、DNA电泳缓冲液(TBE)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(