四妙丸干预实验性兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡与增殖的实验研究

《四妙丸干预实验性兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡与增殖的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第十一届全国中医风湿病学术研讨会专辑一实验研究·87·四妙丸干预实验性兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡与增殖的实验研究中国人民解放军第401医院(青岛266071)刘建樊冰1周海蓉1姜萍1周翠英1主题词四妙丸治疗应用膝骨关节炎／中医药疗法软骨细胞／生理学实验研究动物兔据统计在我国50岁以上的人口中，膝骨关节炎(KOA)的发病率为9．56％；在60岁以上的人口中，膝骨关节炎的发病率高达78．5％。骨关节炎关节软骨中有过度的软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞凋亡成为防治骨关节炎的重要途径。1材料与方法1．1实验动物健康新西兰白兔40只，雌雄各半，体重2500～30

2、009，山东大学实验动物中心提供。1．2实验药物四妙丸处方、苍术159、黄柏(炒)159、怀牛膝(炒)309、薏苡仁609。以上述比例水煎浓缩成含生药l∥rIll的溶液。维固力配制成含硫酸氨基葡萄糖25mg／ml的溶液(维固力胶囊：每粒含硫酸氨基葡萄糖250mg，批号：C04090A，爱尔兰罗达药厂)。1．3造模方法右后肢管型石膏伸直位制动法造模：将兔固定于动物实验台上，右后肢处于伸直位，石膏绷带浸水后包扎于兔右后肢膝关节，松紧适中，长度约15era，待石膏绷带干燥，放回笼中饲养。1．4动物分组及给药方法40只新西兰白兔，随机分为4组，3组造模

3、，l组不造模。空白对照组：不造模，每日灌服10ml生理盐水。模型对照组：造模后每日灌服lOrnl生理盐水。四妙丸组：造模后每日灌服相当于生药49／kg的溶液。维固力组：造模后每Et灌服相当于硫酸氨基葡萄糖75mg／kg的溶液。1．5标本制备全部动物在7周末处死，立即解剖右侧膝关节。每组随机取2只兔子，用手术刀切取1cm×1cm胫骨平台全层软骨，立即放入4℃的戊二醛中固定，供扫描电镜观察用；余胫骨平台软骨放入10％的甲醛溶液中固定，供HE和Masson染色、软骨细胞凋亡增殖测试。股骨内髁全层软骨切下后，用生理盐水漂洗后，放置无菌标本盒中标号，迅速

4、于一80℃1山东中医药大学附属医院超低温冰箱内冷冻保存，供RT-PCR检测。1．6检测方法电镜观察软骨改变；光镜下HE和Masgon染色形态学观察，软骨滑膜Mankin等级评分；采用免疫组织化学方法，TUNEL检测降低软骨细胞的凋亡指数(AI)、PCNA检测增殖指数(PI)；逆转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)检测软骨细胞bcl．2mR—NA、baxmRNA表达。1．7统计方法实验数据用SAS软件统计分析，计数资料用z2检验，计量资料用t检验，等级资料用Pddit分析。检验显著性水平定于P<0．05。2结果2．1Mankin评分空白对照组为0

5、．38±0．13分，模型对照组为10．56±3．87分，维固力组为3．97±1．49分，四妙丸组为4．58±1．63分。2．2组织病理学观察本研究结果显示，四妙丸组电镜下软骨、光镜下软骨滑膜的病理改变明显减轻，Mankin评分降低，与模型对照组相比有显著性差异(P<0．01)，其作用与维固力相近。提示四妙丸可以抑制滑膜炎症，延缓软骨损伤。四妙丸可能通过抑制滑膜炎性改变，减少滑膜炎性物质从滑膜释放入滑液，从而阻碍炎性滑膜对软骨的炎性破坏。2．3对软骨细胞凋亡与增殖的影响2．3．1对软骨细胞凋亡的影响脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标

6、记法(TUNEL)法能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，在细胞凋亡的研究中被广泛采用。本研究结果显示，四妙丸组软骨细胞的凋亡指数(AI)降低，与模型对照组相比有显著性差异(P<0．05)，其作用与维固力相近(表1)。提示四妙丸可以抑制软骨细胞凋亡。表明四妙丸可以通过抑制软骨细胞凋亡，改善软骨病变。2．3．2对软骨细胞增殖的影响增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。免疫组化检测软骨细胞PCNA的表达可以反映软骨细胞的增殖状况。结果如表l所示(下转第95页)，·94

7、·中国中医风湿病学杂志2006年第9卷第3、4期(38．7％)，较其他各型明显升高，药物治疗效果不佳，有66．6％的患儿不能完全缓解，可见本型患儿有死亡可能，缓解率低，致残率高，预后不良。在本组病人中有l例初期诊断为全身型，但2年后死于淋巴瘤，我们在多年临床工作中(非本组患JL)类似情况时有发生，提示部分满足肛A诊断标准的患儿可能为肿瘤早期或有向恶性肿瘤转化的倾向，故在本病诊断中尚须寻找更特异的客观标准，并应注意除外感染、肿瘤等其他疾病，在2001年修改版的JM诊断标准中强调了JM诊断中须除外其他的疾病，我们认为是十分必要的。本组病例中ERA型

8、占比例为30．8％，发病比例较高，其中HLA．踢阳性89．15％，有55．2％发展为强直性脊柱炎。提示本型具有年长男孩，以下肢大关节炎起病，可合并有肌