补肾康膝方对家兔软骨细胞增殖与凋亡的影响

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1、补肾康膝方对家兔软骨细胞增殖与凋亡的影响【摘要】　　目的观察补肾康膝方含药血清对体外培养的兔关节软骨细胞的增殖凋亡和端粒酶活性的影响。方法取兔的关节软骨，将软骨细胞分离传代后,分为补肾康膝方含药血清组和对照组，置入37℃，50ml/L的CO2培养箱内培养7d后,采用MTT法检测细胞增殖;TUNEL法检测各组软骨细胞的凋亡；软骨细胞经扩增后用ELISA检测端粒酶活性。结果补肾康膝方高、中、低剂量组细胞增殖均高于对照组(P<0.05)；补肾康膝方含药血清各组的软骨细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.05)；补肾康膝方含药血清各组的软骨细胞端粒酶活性明显高于对照组。结论补肾康膝方

2、可能通过上调软骨细胞端粒酶活性,从而抑制软骨细胞的凋亡。【关键词】补肾方；软骨细胞；细胞凋亡；端粒酶　　Abstract:ObjectiveToobservetheeffectsofkidney-supplementing,knee-invigorating(KSKI)Prescriptioncontainingserumonproliferationandapoptosisofrabbitchondrocytesinvitro.MethodsThechondrocytesthecartilageoftherabbits,andgroupsandcontrolgroup.Aftert

3、hechondrocytesl/LCO2incubator,thEirproliferation,apoptosisandthetelomeraseactivitygroupseraseactivitieseraseactivity.　　Keyenting；Knee-invigoratingprescription；Chondrocytes；Apoptosis；Telomerase　　骨关节炎主要的病理特征是软骨骨质的降解和软骨中细胞数目明显减少，软骨基质的合成和分解代谢失调，最终关节软骨被破坏。研究表明，软骨中唯一的细胞是软骨细胞，软骨基质主要是由软骨细胞合成和分泌的；软骨细胞的分

4、裂增殖及凋亡的异常在骨关节炎的发病中起到十分重要的作用。补肾康膝方是治疗骨关节炎的经验方，对早期骨关节炎疗效显著，本研究主要从补肾康膝方对软骨细胞增殖和凋亡的影响探讨其防治骨关节炎的作用机制，为进一步研发和临床运用打下基础。　　1材料与仪器　　1.1动物　　　新西兰兔1个月龄大，体质量2.5kg，雌雄各5只，由贵阳医学院动物实验中心提供。　　1.2试剂　　　胎牛血清(美国Sigma,使用前灭活)、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma)、1.0g/L胰蛋白酶、0.2g/LEDTA、DMEM培养液(Gibco公司)、二甲基亚砜、MTT(美国Sigma公司)、端粒酶PCR2ELISA检测试剂盒(德国

5、BoehringerManheiman)、TUNEL成套试剂盒(湖北省武汉博士德生物工程公司产品)。　　1.3仪器设备　　　Olympus倒置显微镜、培养箱(HeraeusB25060EK2CO2)、超净台(上海净化设备厂CSB21)、冷冻高速离心机(Heraeeus)、酶标分析仪(KⅡ)。　　2方法　　2.1兔血清制备　　　新西兰兔4只，雌雄各半。补肾康膝方(由淫羊藿、黄芪、牛膝、石斛、远志、骨碎补、补骨脂等组成)按体表面积折算动物的等效剂量，再按10ml/d灌胃，正常兔血清以9.0g/L氯化钠注射液按10ml/d灌胃。连续灌胃2次，中间间隔2h，分别在末次灌胃后3h采血。在乙醚和

6、氯胺酮复合麻醉下兔腹主动脉采血，4℃冰箱过夜后，离心(2500r/min)25min，取上清液，抽滤除菌后分装，-20℃保存备用。　　2.2兔软骨细胞的分离与培养将6只新西兰兔空气栓塞处死后,无菌条件下截取双侧胫骨近端、股骨远端关节软骨，置于D-Hank's液中冲洗。0.5g/L透明质酸酶溶液室温下消化3min，将软骨切成约1mm3大小，分别以2.0g/L胰蛋白酶、2.0g/L胶原酶溶液于37℃，50ml/LCO2培养箱中孵育60min，1500r/min离心3min，弃上清液，网筛过滤后,加入100ml/L小牛血清，反复吹打后将软骨细胞接种在25cm2的培养瓶中，置37℃，50ml

7、/LCO2培养箱中。原代细胞长满后传代培养。　　2.3含药血清的加入传代细胞接种在24孔板中，接种密度2×104个/cm2，分对照组(正常兔血清)、补肾康膝方Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组(含药血清分别为5%，10%，20%)。每组选6个培养孔，分别用相应的血清培养。　　2.4检测方法及观测指标　　2.4.1MTT比色法检测软骨细胞增殖　　软骨细胞培养7d后，每孔加MTT20μl(5mg/ml)溶于PBS中，滤过除菌，放入培养箱4h，取出，每孔加入50μl二甲基亚砜，振荡混