中药补肾方对体外培养软骨细胞影响

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1、中药补肾方对体外培养软骨细胞影响赵瑜，冯齐凤，朱祝生，刘日光【摘要】　　目的为了解中药补肾方对体外培养软骨细胞的作用。方法取TT法检测细胞增殖；TUNEL法检测各组软骨细胞的凋亡。结果中药补肾方高、中、低剂量组细胞增殖均高于对照组(P0.05)；中药补肾方含药血清各组的软骨细胞凋亡率明显低于对照组(P0.05)。结论中药补肾方可促进软骨细胞增殖与抑制软骨细胞的凋亡。【关键词】补肾方细胞培养软骨细胞　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofkidney-supplementingPrescriptionextractedfro

2、mtraditionalChinesemedicineonChondrocytesculturedinvitro.MethodsThechondrocytesthecartilageofEM培养液(Gibco)、二甲基亚砜、MTT(美国Sigma)、TUNEL成套试剂盒(湖北省武汉博士德生物工程公司产品)。　　1.3鼠血清制备　　　EM全培养基（含100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，10-8M地塞米松，VitC50μg/ml），将细胞团制成悬液，以200目筛网过筛，收集滤液，以6×106/ml密度接种，置37°C，5%CO2培养箱中培养，首次换液在3d后，其后每2

3、d换液1次，至细胞长满培养瓶时传代。　　1.5含药血清的加入　　　传代细胞接种在24孔板中，接种密度2×104个/cm2,分对照组(正常血清)、补肾方实验组(含药血清分别为5%，10%，20%)。每组选6个培养孔，分别用相应的血清培养。　　1.6MTT增殖测定软骨细胞培养5d后，每孔加MTT20μl(5mg/ml)溶于PBS中,滤过除菌,放入培养箱4h，取出，每孔加入50μl二甲基亚砜，振荡混匀使结晶物充分溶解。在全自动酶标仪上检测光密度(OD)值，检测波长为492nm。　　1.7TUNEL法检测软骨细胞的凋亡按检测试剂盒说明书操作。以胞浆出现棕色细小颗粒为阳性结果。阳性

4、率计算：计数5个视野中的阳性细胞核(胞浆)数及总细胞核数，并计算阳性细胞核数占细胞核总数的百分比。　　1.8数据处理采用SPSS10.0统计软件包进行独立样本t检验，数据以±s表示。　　2结果　　不同浓度的补肾方含药血清对培养软骨细胞均显示增殖刺激作用，与对照组比较P0.05。不同浓度的补肾方含药血清对软骨细胞凋亡率明显低于对照组,差异存在显著性P0.05。结果见表1。表1补肾方对家兔软骨细胞增殖、凋亡率（略）　　3讨论　　骨关节炎是一种临床常见的老年人关节的退行性病变，它的发病率与年龄密切相关。Cooper等〔1〕研究表明，60岁后，100%的人膝关节软骨将发生组织学退

5、变；60%～70%的个体存在确定的膝OA证据。我国50岁以上的人群中骨关节炎的发病率约为50%，而65岁以上患有此病的女性和男性分别高达90%和80%。　软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，它与由其分泌的细胞外基质共同组成具有独特力学和生物学特性的物质，即软骨。因此，软骨细胞在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用。骨关节炎是以关节软骨丢失以及软骨细胞功能降低或丧失为主要特征的一类退行性关节疾病。但软骨的修复是一个复杂的组织学变化过程，软骨细胞在骨关节炎修复中起着十分重要的作用。如何促进软骨细胞的增殖和延缓软骨细胞凋亡，是需要研究的问题。　　中医药学在骨关节病的临床治疗中

6、积累了丰富的经验，为了进一步研究中医药延缓软骨退变的作用机理，有必要建立软骨细胞体外培养体系。而中药复方多数是通过口服而起作用的，用中药粗制剂直接加入离体反应体系中进行实验研究，在方法学上存在很多问题，如：中药中的杂质成分、各种电解质或鞣质、以及不同酸碱度的影响等，都会对实验结果造成一定的影响〔2，3〕。而用含药血清进行体外实验，可以排除以上各种因素的影响,比较接近药物体内环境中产生药理效应的过程。MTT光密度表达，反映了细胞增殖活性，反映一定时间的细胞增殖速度〔4〕。细胞凋亡的检测方法主要包括形态学、生物化学、细胞学和分子生物学等改变。其中最重要和特征性的改变是Ca2+

7、/Mg2+依赖性核酸内切酶的激活导致染色质DNA在核心小体连接部位断裂，形成以180～200bp为最小单位的单体或寡聚体片段。因此，细胞凋亡过程中DNA降解所产生的DNA片段大小具有独特性质，常作为细胞凋亡特异性指标，其中TUNEL法则被广泛应用的方法之一。本实验结果表明，中药补肾方含药血清各浓度组的软骨细胞增殖OD值明显高于对照组(P0.05)，说明其能促进软骨细胞的增生；而软骨细胞凋亡率明显低于对照组(P0.05)，说明其具有抑制软骨细胞的异常凋亡的功效；说明中药补肾方能通过抑制软骨细胞异常凋亡，促进软骨细胞增殖从而起到防