补肾、柔肝中药对软骨细胞生物功能的影响

《补肾、柔肝中药对软骨细胞生物功能的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据·146·中国医药学报2004年第19卷增刊200403—．19JC—-20上海市中医药研究院骨伤科研究所石印玉冯伟曹月龙郑昱新詹红生徐宇徐超补肾、柔肝中药对软骨细胞生物功能的影响石印玉曹月龙冯伟郑昱新石瑛王翔(上海中医药大学附属曙光医院骨伤研究所，上海200000)摘要：目的：比较补肾方和柔肝方对体外软骨细胞生物学特征的影响。方法：用补肾方和柔肝方含药血清培养软骨细胞，以MTr法检测细胞增殖能力并确定相关血清药理学的主要参数，综合运用组织细胞学、组织化学和分子生物学等方法观察比较含药血清对软骨细胞生物学性能的影响。结果：补肾方和柔肝方均能促进体外软骨细胞的

2、增殖；促进细胞外基质胶原和蛋白多糖的合成；对软骨细胞分泌的PGE：无抑制作用。同时也不诱导软骨细胞异常分泌MMP一3。结论：补肾方和柔肝方对体外软骨细胞生物学特征的影响具有相似的作用，即促进软骨细胞的增殖和基质的合成。因此，为中医药以调摄肝肾为治疗原则防治退行性骨关节炎提供了细胞学依据。关键词：软骨细胞；中医药；基质；胶原；蛋白多糖；前列腺素E2(PGE2)；金属蛋白酶(MMP-3)骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退变为特征的慢性关节疾病，发病率随年龄增长而增加。国外报道，60岁以上者，75％一80％可见OA的x线征象，20％有疼痛和活

3、动受限。国内调查结果OA发病率达2．2％一9％，其中北京郊区一项调查证实人群总患病率为9．56％，老年人群高达50％以上。体外软骨细胞培养是研究关节软骨的重要方法之一，因为改变了软骨细胞的生存环境，必须通过控制相关实验参数来保持软骨细胞的功能和表现型。国内于1994年开始有血清药理学实验研究的有关文献报道。运用此方法，可以直接观察中药的药效学效应，尽管血清药理学还存在诸如血清采集时间、动物给药量与血清药效的关系、含药血清浓度与血清药效的关系以及起效成分测定困难等问题，但它提供了一种研究中药的新方法。基于以上背景。本项目在补肾方和柔肝方临床和动物实验有效的基础上，运用

4、血清药理和体外培养软骨细胞的方法，探讨补肾、柔肝中药对软骨细胞生物学功能的影响。软骨细胞的培养及形态学与免疫组化观察实验一细胞分离培养与形态观察1．材料与方法1．1主要试剂DMEM培养液、粗品胶原酶、胰蛋白酶、D．Hank’s平衡液、小牛血清。1．2主要仪器与材料培养箱(HeraeusB一5060EK—CO：)、超净台(上海净化设备厂CSB—1)、倒置显微镜IOLYMPUS)、恒温水浴锅、恒温磁力搅拌器、眼科手术器械，低温离心机(typeMegafuge1．OR，Germany)、120目尼龙网筛过滤器、培养瓶(Unclon，丹麦)、计数器。1．3动物4W龄健康新西

5、兰种白兔。1．4软骨细胞的分离和培养参用分阶段酶消化法进行【l’1引。2．结果倒置显微镜观察和甲苯胺蓝染色形态学观察¨】．12j：分离、培养的原代软骨细胞呈圆球形，悬浮12h逐渐开始贴壁，24h大部分贴壁，5—7天细胞铺满，形成单层细胞层；此时细胞密集，细胞融合边界不太清晰，胞核较大呈圆形或椭圆形，细胞有聚集成簇或丛状，分泌基质旺盛，分泌物堆积如菊花状．此处的细胞和细胞核不清，甲苯胺蓝异染为深紫蓝色。第l一2代传代细胞生长似原代细胞。实验二软骨细胞的免疫组织化学染色u卜b11．材料与方法1．1主要试剂Ⅱ型胶原单克隆抗体(FU-JI)、全组分SP免疫组化检测试剂盒(华

6、美)、玻片(经酸处理和高温灭菌、大小已切割好)，PBS万方数据2似年第19卷增刊中国医药学报平衡液(7．4)、95％酒精、湿盒。1．2方法参照免疫组化ABC法进行。2．结果胞浆和细胞间隙有散在的棕色团块，为阳性染色，团块颜色不均匀，所培养的细胞是具有分泌特异性Ⅱ型胶原的软骨细胞，可以用来实验。含药血清对软骨细胞增殖动力学研究及相关血清药理学参数的确定实验一含药兔血清制备¨6．17】1．材料与方法1．1器械18号和20号留置针、灌胃器、手术器械、试管、过滤器、0．451a,滤膜、注射器、麻醉药品(乙醚：吸人；氯胺酮：肌注)、定时器、离心机。1．2药品柔肝方由白芍、牡蛎

7、等养血柔肝药组成，简称A；补肾方由熟地黄、仙灵脾等药组成，简称T；补肾方[批号：981012]、柔肝方[批号：990614]为曙光医院院内制剂；维骨力(简称w，批号：03897)和扶他林(简称F，批号：99015)在医院药房购买。1．3方法将药物按体表面积折算成动物的等效剂量，再用生理盐水配成8ml／d溶液灌胃，正常兔血清以生理盐水8ml／d灌胃。连续两次灌胃，中间间隔2h，分别在末次灌胃的1、3、5h采血，以确定短时间内灌胃合适的给药方案和采血时间点；然后与连续灌胃8d所采的血清进行比较，以观察1d短时间内和8d长时间内灌胃所取血清对软骨细胞的影响，以确定长、