MiRNA-145对软骨细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究.pdf

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1、分类号：R684.3密级：公开学校代码：11065学号：Y0115130090专业博士学位论文MiRNA-145对软骨细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究作者姓名王国栋指导教师孟纯阳教授专业领域外科学（骨外）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月18日MiRNA-145对软骨细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究摘要目的：明确微小RNA（microRNA，miRNA）-145对膝关节骨关节炎（osteoarthritis，OA）软骨细胞増殖与调亡行为的影响，并从miR-145、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinylaspartatespe

2、cificproteinase，caspase）-3与长链非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）-ROR相互调控的角度分析其作用途径，为完善OA病理机制、进一步阐明原发性OA的分子机制，并为临床治疗提供新的分子靶点。方法：1OA软骨细胞的培养和标本分组标本全部来自于济宁医学院附属医院的患者，实验组选自因膝关节OA接受膝关节表面置换术或关节镜下清理术的患者共20例，其中男性12例，女性8例，年龄48~70岁，平均年龄59.50±5.95岁；同一时期内，对照组选自因下肢毁损伤行截肢术的患者10例，其中男性4例，女性6例，年龄4

3、9~73岁，平均年龄54.85±6.97岁。上述所有患者均自愿捐献术中的软骨和滑膜组织。实验组即OA组纳入标准：根据2007年《骨关节炎诊治指南》中膝关节OA的诊断标准，上述所有患者均排除类风湿性关节炎、创伤性关节炎、化脓性关节炎等疾病；对照组即正常软骨组纳入标准：在临床上，患者家族中无类风湿性关节炎等风湿性疾病，无免疫性疾病病史，膝关节无肿胀疼痛等临床表现，未因膝关节不适就诊或接受治疗；每例标本均得到患者完全知情同意；2OA软骨细胞和正常软骨细胞的miR-145、caspase-3、Bax的表达，纳入实验的OA软骨细胞和正常软骨细胞，采用96孔板

4、培养，37℃，5%CO2培养48小时，采用实时定量PCR实验测定miR-145、caspase-3、Bax表达水平，westernblot测定caspase-3、Bax蛋白表达水平，对比各个指标的组间差异；3软骨细胞増殖活力测定利用CCK-8细胞増殖活力实验，软骨细胞调亡率测定采用AnnexinV和PI双染流式细胞实验；分析各组之间的差异。生物学信息方法（MiRanda软件）预测miRNA和靶基因的结合位点，推测caspase-3可能为miR-145的下游靶基因，构建野生型或突变型双荧光素酶报告质粒，转染，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行荧光素

5、酶活性分析。4OA软骨细胞中miR-145与lncRNA-ROR的相关性检测I入组的膝关节OA和正常软骨细胞，在5%CO2、37℃条件下培养，采用PCR测定lncRNA-ROR表达水平，分析miR-145表达与lncRNA-RORmiRNA表达的相关性；5OA软骨细胞miR-145与lncRNA-ROR的相互作用使用脂质体2000将PCDNA3.1-MS2、PCDNA3.1-MS2-lncRNA-ROR或PCDNA-3.1-MS2-mut和PMS2-GFP细胞进行共转染，培养，再用EZMagnaROPRNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒对细胞使用GFP抗体

6、进行RIP分析。通过双荧光素酶受体分析系统测量荧光素活性；干扰lncRNA-ROR表达后，采用CCK-8细胞増殖活力实验测定细胞増殖活力，与对照组相比，明确组间差异。结果：1caspase-3与Bax在OA软骨中的表达检测原发性膝关节OA及正常人软骨与滑膜中caspase-3与Bax的表达水平，以内参基因GAPDH为参照，从溶解曲线得出结论，caspase-3及Bax的溶解曲线为单峰，意味着没有特异性扩增产物生成，可以取得特异性良好的引物。经PCR扩增得到各个目的基因的Ct值，采取相对定量的2-ΔΔCT方法分析caspase-3及Bax与GAPDH

7、拷贝数的比值，OA软骨与滑膜组织标本中caspase-3的表达量分别为4.245±0.526与3.647±0.352，明显高于正常人中的，差异有统计学意义（P＜0.01），Bax的表达量分别为3.565±0.382与2.412±0.225，明显高于正常人软骨与滑膜组织，差异有统计学意义（P＜0.01）；应用western-blot检测原发性膝关节OA及正常人软骨与滑膜caspase-3与Bax蛋白的表达水平，以内参基因GAPDH为参照，OA软骨与滑膜组织标本中caspase-3及Bax的表达量明显高于正常人中的，差异有统计学意义（P＜0.01）。以

8、内参基因U6为参照，经实时荧光定量PCR扩增得到各目的基因的Ct值，以2-ΔΔCT相对定量的方法分析miR-145与U6拷