补肾壮骨法对人骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡衣基质代谢的影响

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1、中国中医科学院硕士学位论文补肾壮骨法对人骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡衣基质代谢的影响姓名：王海南申请学位级别：硕士专业：中医内科学指导教师：殷海波；刘宏潇20120528补肾壮骨法对人骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及基质代谢的影响中文摘要骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是关节软骨的退行性病变，软骨破坏是其主要的病理特点。骨关节炎严重影响患者的生活质量，同时给家庭和社会带来了巨大的经济负担。目前，NSAIDs(非甾类抗炎药)类药物是用于治疗OA最常用的处方药，虽然能够缓解患者的疼痛，但并不

2、能抑制软骨破坏及延缓OA进程。中医药治疗OA具有疗效好、副作用小的优势。前期临床研究发现补肾壮骨法治疗OA疗效显著，总有效率为90％，能够改善患者关节疼痛、肿胀，改善关节功能：实验研究发现补肾壮骨法能够改善OA动物模型关节结构紊乱，抑制软骨细胞数量减少。因此，深入研究中医药抑制软骨破坏发挥软骨保护作用及其可能的分子机制是非常必要的。本课题在补肾壮骨法治疗OA的学术思想指导下，以国家自然基金为依托，以体外培养的人OA软骨细胞为研究对象，采用中药血清药理学，借助现代分子生物学技术，研究补肾壮骨法对细

3、胞增殖、凋亡及基质代谢的影响。l实验研究一：人骨关节炎软骨细胞系建立与鉴定‘目的：建立人骨关节炎软骨细胞有限细胞系，观察其生长和形态特性，为进一步开展OA软骨细胞分解代解及药物发挥软骨保护作用相关领域的细胞分子生物学研究提供物质基础和实验模型。方法：在北医三院骨关节矫形中心协助下，取需作全膝关节置换手术的oA患者lO例(女性，65．85岁)，采用酶消化原代培养法建立人OA软骨细胞系。应用M1T比色法检测细胞增殖特性；采用甲苯胺蓝染色与II型胶原免疫组化鉴定细胞来源；倒置显微镜下观察细胞生长、形态

4、变化。结果：成功建立了人骨关节炎软骨细胞有限细胞系，细胞生长状态良好，生物学性状稳定；甲苯胺蓝与II型胶原免疫组化证明所培养的细胞为来自中胚层的软骨细胞。结论：本实验采用酶消化原代培养法，成功建立了生物学性状稳定的OA软骨细胞有限细胞系，经鉴定为中胚层来源的软骨细胞，为研究OA发病机制及药物干预细胞基质代谢作用提供了较好体外模型。中国中医科学院二oo九级硕士研究生学位论文2实验研究二：人骨关节炎软骨细胞增殖、细胞周期及凋亡研究目的：以正常人膝关节软骨细胞为对照，观察体外培养OA软骨细胞增殖、细胞

5、周期及凋亡特征，研究OA软骨细胞的基本生物学特性。方法：在北医三院骨关节矫形中心协助下，取因外伤急性截肢患者的软骨组织以及全膝关节置换手术OA患者的软骨组织，采用酶消化培养法培养人软骨细胞。应用MTT比色法检测OA软骨细胞与正常软骨细胞的增殖特性；采用流式细胞术检测OA软骨细胞与正常软骨细胞周期特点与凋亡率的不同。结果：OA软骨细胞较正常软骨细胞表现为过度凋亡(P

6、缓慢可能是加速OA软骨破坏的重要因素。3实验研究三：人骨关节炎软骨细胞IL．1B蛋白表达状况目的：以正常软骨细胞为对照，观察OA软骨细胞上清液中IL．1B(int甜euldn-lp)含量及软骨细胞IL广lp蛋白表达状况，探讨IL-lp在OA发生发展中的作用。方法：采用ELISA法比较OA软骨细胞和正常软骨细胞上清液中IL．1D的含量；采用Westernb10t技术检测OA软骨细胞和正常软骨细胞IL．1p蛋白表达情况。结果：OA软骨细胞较正常软骨细胞上清液中ILlp含量增多(P

7、lD蛋白表达增强(P

8、况。结果：OA软骨细胞MMP．1、MMP．3、MMP．13蛋白表达较正常软骨细胞明2补肾壮骨法对人骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及基质代谢的影响显增强(P<0．01)。结论：金属基质蛋白酶在OA发生发展中发挥重要作用，可通过降解细胞外基质，加速细胞外基质的分解代谢，导致OA软骨破坏的发生。5实验研究五：牛膝健步颗粒对人骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响目的：以正常软骨细胞为对照，探讨牛膝健步颗粒对体外培养OA软骨细胞增殖及凋亡的影响。方法：将软骨细胞分成正常软骨细胞组、OA软骨细胞组、OA软骨细胞组+