白藜芦醇对人骨髓基质细胞增殖及成骨分化的影响.pdf

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1、．3140．堕堂至旦笙堂篁塑!竺!!竺!!lOct．2014，Vo1．35，N。．20白藜芦醇对人骨髓基质细胞增殖及成骨分化的影响术蔡德，许卫铭，陈航，李雄广东医学院附属医院药学部，骨科(广东湛江524001)；广东医学院药理学教研室(广东湛江524023)；广东省珠海市人民医院药学部(519000)【摘要】目的观察白藜芦醇对体外培养人骨髓基质细胞(BMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法用传代贴壁筛选的方法分离纯化人BMSCs，加入白藜芦醇后1、2、3d用Mr丌法检测白藜芦醇对BMSCs增殖的作用，加白藜芦醇后3、5、7、9d用PNPP法观察白藜芦醇对BMSCs成骨诱导后细

2、胞碱性磷酸酶(AIJP)活性的影响。结果传代贴壁筛选的方法可得到BMSCs，经诱导后可向成骨细胞方向分化。10molfL浓度的白藜芦醇可以抑制人BMSCs的增殖。白藜芦醇可以增加人BMSCs成骨诱导后细胞ALp的含量，其中以10mol／L浓度作用7d时效果明显。结论白黎芦醇能促进人BMSCs向成骨细胞方向分化。【关键词】白藜芦醇；骨髓基质细胞；成骨细胞；增殖；分化白黎芦醇(resveratro1)是一种含有茂类结构的非髓来自正常献髓者，采用全骨髓培养法。吹打均匀后黄酮类多酚化合物，在植物受到病原体攻击或者环境以4×10·am密度接种到25mL培养瓶中，在恶化时产生，被认为是

3、一种植物抗毒素，存在于多种植37oC、5％CO的C0：孵箱中静置培养。24h后首次半物中，在新鲜的葡萄皮中含量最高。天然白黎芦醇有量更换培养液，去除悬浮细胞，以后每3～4d换液1次，顺式和反式两种异构体，在许多植物中常与两者各自细胞70％～80％融合后用胰酶消化传代。用传至第3的3B—D葡萄糖苷同时存在，但白黎芦醇苷在肠道中代的BMSCs进行诱导分化实验。每项实验重复2次。可被糖苷酶分解，释放出白黎芦醇发挥对人体有益的1．2．2MrITr法检测细胞的增殖将经传3代的BM—保健作用，比较明确的是对心血管系统的保护作用和SCs以2×10·cl'n密度加入96孔板，每孑L100L

4、，对神经退行性疾病的有益作用。有实验提示其促进成24h后换含1％胎牛血清的培养基继续培养。实验分骨的作用以及雌激素样作用等使其可能成为治疗骨质为3组：对照组仅加入成骨条件培养基；成骨诱导组加疏松症的有效药物，但目前白藜芦醇对人骨髓基质细入成骨诱导液(内含B磷酸甘油0．01mol／L、抗坏血酸胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)成骨分化作用的50g／mL、地塞米松10mol／L)；加药组加入不同浓研究较少。2011年6月至2013年7月，本实验观察白度的白藜芦醇，终浓度为10一、l0一、10～、10～、10藜芦醇对人BMSCs增殖及成骨分化的影响，为

5、用白藜mol／L。加药后1、2、3d进行检测，实验结束前4h加芦醇防治骨质疏松提供更多的实验依据。20的M1TI’(5L)，继续在37℃、5％CO条件下孵1材料与方法育4h，吸取培养液加二甲基亚砜0．15mL，振摇至结晶完全溶解后于酶标仪检测其吸光度(OD值)，检测波1．1试剂与仪器HumanMSCmedium购自Cyagen公司，胎牛血清购自Gibco公司，MrItI1、8甘油磷酸钠、L长570nm，参考波长630nm。1．2．3ALP染色成骨诱导后用改良Gomori钙钴法抗坏血酸、地塞米松和白藜芦醇标准品购白Sigma公司，碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒购自南京建成生物

6、进行ALP染色，以鉴定成骨细胞。细胞中的ALP在碱性的缓冲液中催化底物水解，生成物进而与一种稳定有限公司；NAPCO二氧化碳恒温培养箱(5420—1，Pre．cisionScientific，美国)，XD一101倒置相差显微镜(江的重氮盐偶联，生成不溶性的偶氮染料，沉着于有ALP南光电股份有限公司)，酶标仪(Bio—ELX一800型，美活性的部位。操作按试剂盒说明进行。ALP阳性细胞国)。胞浆应呈现灰黑色颗粒，颜色越深表示酶含量越高。1．2方法1．2．4PNPP法检测ALP活性将经传3代的BMSCs以2×10·cm密度加入96孑L板，每孔100L。培养1．2．1人BMSCs

7、的制备及培养无菌取人骨髓，骨48h后，实验分为3组：对照组仅加入成骨条件培养基；成骨诱导组加入成骨诱导液(内含B磷酸甘油女2012年广东省第一批产业技术研究与开发资金计划项目(编号：2012B031800225)，2011年度广东省湛江市第二批非资助科技攻0．O1mol／L、抗坏血酸50g／mL、地塞米松10一mol／L)；关计划项目(编号：2011C3102022)加药组加入不同浓度的白藜芦醇，白藜芦醇终浓度为△通信作者。E—mail：lixiong612@163．conl0～、1O～、10～、10～、10～mo