白藜芦醇对肝癌bel7404细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

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1、白藜芦醇对肝癌Bel7404细胞增殖、凋亡及侵袭的影响【摘要】目的研究白藜芦醇对肝癌Bel7404细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。方法MTT法和增殖细胞核抗原(PA)测定法检测白藜芦醇对Bel7404细胞增殖的影响;流式细胞术和TdT酶介导的dUTP缺口末端标记法检测白藜芦醇对Bel7404细胞凋亡的影响;黏附实验、运动实验和侵袭实验检测白藜芦醇对Bel7404细胞侵袭能力的影响。结果白藜芦醇浓度>25μmol/L可抑制肝癌细胞Bel7404增殖,并诱导凋亡(P<0.01);浓度>100μmol/L正常肝细胞L02的增殖也受到抑制,并产生凋亡(P

2、<0.01)。25,50μmol/L的白藜芦醇可抑制Bel7404细胞黏附细胞外基质纤连蛋白(FN)及降解基质的能力(P<0.01),对该细胞的运动能力无明显抑制作用。结论一定浓度的白藜芦醇可抑制肝癌Bel7404细胞增殖，诱导其凋亡,并可能通过抑制Bel7404细胞与细胞外基质FN的黏附及对基质的降解来抑制Bel7404细胞的侵袭能力;在较高浓度下(≥100μmol/L),白藜芦醇对正常肝细胞株也产生抑制增殖和诱导凋亡的毒性作用。【关键词】藜芦生物碱类癌肝细胞肝肿瘤细胞增殖细胞凋亡肿瘤侵润自从葡萄酒中发现白藜芦醇以来,人们陆续发现它具有保护心肌细胞、

3、改善微循环、抑制血小板聚集、抗内毒素休克、降血脂、抗脂质过氧化、镇咳、平喘、抗病原微生物及抗老年痴呆等众多生理功能。近年来又发现白藜芦醇具有抗肿瘤功能,表现为对某些肿瘤的起始、促进、进展3个阶段均有抑制作用[1]。白藜芦醇并非对所有肿瘤都有抑制作用,而且其抗肿瘤机制目前尚不明确。肝癌为我国最常见的恶性肿瘤之一,是重要的抗肿瘤研究对象。笔者从肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭方面探讨白藜芦醇的抗肝癌细胞株机制,以及对正常肝细胞的毒性作用。1材料与方法1.1材料肝癌细胞Bel7404及正常肝细胞L02均由福建省肝胆外科研究所提供;白藜芦醇由福建师范大学生物工程学院提纯生产(纯度约99

4、.8%);RPMI1640和DMEM培养基(美国Gibco公司);噻唑蓝(thiazolylblue,MTT)、胰蛋白酶(北京华美生物科技有限公司);PA试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);TUNEL试剂盒(美国Premega公司);TransL1单细胞悬液,按每孔100μL接种于96孔板,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50,100,200μmol/L,分别在12,24,48h各取1块板,换不含血清的培养液每孔100μL,各孔中加MTT10μL(5mg/mL),孵育4h,加入MTT裂解液(10%SDS,5%异丁醇,0.012mmol/LHCL)100μL

5、,37℃孵育18h后,酶标仪(BioRad550型,美国BioRad公司)测取D(550nm)的光密度值,取4孔平均值。该值反映活细胞数目,即细胞增殖程度。(2)制备2×105mL1单细胞悬液,接种于置于6孔板中的玻片上,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50,100,200μmol/L。选择48h作为终止时间,按试剂盒说明书进行。以已知PA阳性的乳腺癌细胞作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察,计算PA标记指数,即计数1000个肿瘤细胞中PA阳性细胞的百分率。1.4细胞凋亡测定(1)细胞经过同步化后,即无血清培养24h,再加入10%血清及

6、不同浓度白藜芦醇(12.5,25,50,100,200μmol/L)培养48h。收集悬浮细胞及贴壁细胞,经2000r/min离心5min,沉淀重悬于PBS1mL,400目筛网过滤,取细胞悬(COULTEREPICSXL型,美国BeckmanCoulter公司)488nm激发,605nm检测,每次检测104个细胞。用MultyCycle软件进行DNA含量和细胞凋亡率分析,DNA含量低于G1期二倍体DNA的细胞为亚二倍体细胞。(2)按PA检测方法接种细胞,选择3个浓度白藜芦醇(25,50,100μmol/L)作用细胞48h。按TUNEL试剂盒说明书进行,以DNaseⅠ处理肿瘤

7、细胞作为阳性对照。显微镜下随机计数200个细胞,计算阳性细胞比率。1.5细胞侵袭检测1.5.1细胞黏附试验(MTT法)取96孔培养板,每孔加入FN20μL(100mg/L),风干后置4℃备用,用PBS洗2次重新水化。2×105mL1浓度的Bel7404细胞悬液加入96孔细胞培养板上,每孔100μL,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50μmol/L,每组复3孔。置37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内,分别于30,60,90min后,弃去上清液,PBS冲洗2次除去未黏附细胞。黏附细胞用MTT法在酶标仪上测定D(