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1、人参皂甙-Rh2对人肝癌Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响【摘要】 目的 研究人参皂甙-Rh2(GS-Rh2)对肝癌Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。方法 采用MTT比色法观察GS-Rh2对体外培养的Bel-7404细胞生长的抑制作用;应用流式细胞仪检测凋亡细胞和细胞周期变化;采用免疫组化S-P法检测药物处理前后凋亡相关基因产物p53、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果 ①MTT比色法测定显示,Bel-7404细胞经GS-Rh2作用后生长受抑制,呈剂量依赖性和时间依赖性,半数抑制浓度(IC50)为27.6μg/ml。②流式
2、细胞仪检测证实,GS-Rh2能诱导Bel-7404细胞凋亡。③当GS-Rh2浓度由12.5μg/ml增加至50.0μg/ml时,细胞凋亡率(AR)依次升高;但GS-Rh2浓度进一步增加时,AR未见相应升高。④GS-Rh2可将细胞周期阻滞于G1期。⑤GS-Rh2处理细胞后,突变型p53表达下调而Bax表达上调,Bcl-2在GS-Rh2处理前后无明显变化。结论 ①GS-Rh2能抑制体外培养的Bel-7404细胞增殖并诱导其凋亡;②GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡可能是通过上调Bax表达、下调突变型p53表达以及阻滞细胞周期而实现。【关键
3、词】 人参皂甙-Rh2; 肝肿瘤; 增殖; 凋亡近年来研究发现,我国的名贵中药人参具有抗癌活性,其主要活性成分人参皂甙(Ginsenoside,GS)能诱导肿瘤细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用。人参皂甙单体-Rh2(Ginsenoside-Rh2,GS-Rh2)是一种原人参三醇型皂甙,是红参的主要抗癌成分。我们以人肝癌Bel-7404细胞株为受试对象,研究GS-Rh2对Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响,并采用免疫组化法检测药物处理前后凋亡相关基因产物Bcl-2、Bax和p53蛋白表达的变化,旨在进一步阐明人参抗肿瘤作用的机理,为将其应用于
4、肿瘤的临床治疗提供更多的实验依据。材料与方法一、实验材料与主要仪器人肝癌Bel-7404细胞株:由中国科学院细胞生物研究所引入,南华大学附属第一医院临床医学研究所传代培养;人参皂甙Rh2:购自中国科学院生物制品研究所,溶于PBS(pH7.4)中配成50mg/ml母液,超滤除菌,-20℃保存;RPMI-1640培养基:美国Gibco公司产品;小牛血清(FBS):杭州四季青生物工程公司产品;鼠抗Bcl-2单抗和兔抗Bax多抗:MBI公司产品,购于福州迈新公司;酶联免疫检测仪:第四军医大学与国营华东电子管厂联合研制,型号为DG3022;流式细胞仪
5、:型号为BeckermanCoulterEP-ICS-XL。二、实验方法1.细胞培养:Bel-7404细胞用含10%小牛血清的培养液(含100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素),于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,细胞呈单层生长,达80%左右时传代。2.药物处理:细胞传代后,接种于96孔或24孔培养板内,当细胞50%~60%融合、贴壁良好时,换用含有不同浓度GS-Rh2的培养液。培养至预定时间后进行观测。3.GS-Rh2对细胞生长的抑制作用:取对数期细胞制成细胞悬液,浓度1×105/ml,接种于96孔培养板内,每孔100μl,6h
6、后加入不同浓度的GS-Rh2,使终浓度分别为6.25,12.5,25,50,100μg/ml,每一浓度组均设4孔。对照孔及调零孔加100μl培养液。各孔总体积均为200μl。分别在加药后6,12,24,48,72h采用MTT法检测各孔中细胞的抑制率。用酶联免疫检测仪在570nm波长下测各孔的吸光度(A值),按下列公式计算抑制率(IR):IR(%)=(1-给药孔平均A值/对照孔平均A值)×100%。具体步骤见参考文献。根据不同浓度下的抑制率绘制量效曲线,由此计算出IC50值。4.GS-Rh2诱导凋亡的量效关系及细胞周期分析:本实验共设立5个G
7、S-Rh2浓度组,即A、B、C、D、E五组,浓度分别为0,12.5,25.0,50.0,100.0μg/ml,培养24h后分别收集各组细胞,应用流式细胞仪检测各组的凋亡率和细胞周期变化,分析GS-Rh2诱导凋亡的量效关系。5.GS-Rh2诱导凋亡的时效关系:取25.0μg/ml(IC50的近似值)GS-Rh2分别作用0,12,24,48h后,检测凋亡率。6.凋亡细胞的检测:分别收集各组细胞,每组约1×106个,4℃PBS洗2次(pH=7.2),500r/min,8min,离心去上清,然后加1.5ml70%乙醇重悬并固定细胞。经一系列处理后,
8、上机检测,每组计数10000个细胞,检测凋亡细胞,其中凋亡细胞所占比例即为凋亡率(AR);并分析处于不同周期的细胞比例。详细方法见参考文献[5,6]。7.免疫组化:收集细胞,制备
