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1、HPK1在缺糖缺氧诱导的大鼠海马神经元凋亡中的作用【关键词】造血祖细胞激酶1;缺糖缺氧;凋亡反；义寡核苷酸 Abstract：ObjectiveToinvestigatetheroleofHPK1inhippocampusneuronapoptosisinducedbyoxygen-glucosedeprivation(OGD).MethodsImmunofluorescencetechniquepusneuronunderthefluorescencemicroscopeandtheconfocalmicroscopy.DAPIstainingpusn
2、eurondeathinducedbyOGD.ResultsItpusneuronsculturedinvitroandadministrationofHPK1antisenseoligodeoxynucleotidescouldsignificantlydecreasetheapoptosisofhippocampusneuronspusneuronsatopoieticprogenitorkinase1，HPK1）是造血系统特异性丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，属于哺乳动物Ste20相关蛋白激酶的MAP4K家族［1］。它的N末端由1个STE-20样激酶结构域、
3、4个脯氨酸富集motif、1个caspase切割位点组成，C末端为1个Citron同源结构域。HPK1主要在造血组织和细胞中表达。近年来大量研究结果表明，HPK1参与许多信号级联反应，包括MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)信号、抗原受体信号、凋亡信号、生长因子信号以及细胞因子信号。然而，继往对于HPK1的研究全部集中在造血系统。本实验旨在探讨HPK1是否存在于大鼠海马神经元中，及其在缺糖缺氧(oxygen-glucosedeprivation,OGD)所诱导的大鼠海马神经元凋亡中的作用。 1材料和方法 1.1实验动
4、物及材料清洁级孕17～18天Sprague-Daidine-2-phenylindole,DAPI)、联苯二胺为美国Sigma公司产品,其余试剂为国产分析纯。 HPK1反义寡核苷酸序列（AS-ODNs）5′-AGGGTCCACGACGTCCATCC-3′、HPK1错义寡核苷酸序列（MS-ODNs）5′-CACAGCGTCGTACCCGCAGT-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.2海马神经元培养参考我室顾正林等［2］报道方法,并略作改动。孕17～18天Sprague-Dam3入15～20ml新鲜配制的0.25%胰酶工作液,37℃消化15m
5、in,加入含10%胎牛血清和10%马血清的冰冷的高糖DMEM以终止反应,低速离心3～5min后,吸弃上层溶液并加上述DMEM溶液轻轻吹散,1000r/min离心5min,再次用上述DMEM溶液悬浮细胞,轻轻吹打,200目滤网过滤,以1.0×108个/L的密度接种于L-多聚赖氨酸预处理的24孔培养板中,置于37℃、5%CO2培养箱中,18～24h换为神经元基础培养基全培,半换液2～3次/周。 1.3动物分组及处理随机分组：①正常对照组(Control)，正常细胞不进行OGD组；②细胞缺糖缺氧组（OGD组）；③溶剂对照组（OGD+TE组），体外培养15～18
6、天的大鼠海马神经元，2μmol/LTris-EDTA，连续处理4天后进行OGD，1.5h后换回正常培养基和5％CO2、95％空气、37℃的培养箱内培养；④错义寡核苷酸组（OGD+MS），用1、1.5和2μmol/LHPK1错义寡核苷酸，连续处理4天后进行OGD，方法同TE组；⑤反义寡核苷酸组（OGD+AS），用1、1.5，和2μmol/LHPK1反义寡核苷酸，连续处理4天后进行OGD，方法同TE组。 1.4氧糖剥离(OGD)模型的制备首先将培养箱内充入氮气代替空气，待条件稳定为95％氮气、5%CO2后将培养14天的海马神经元细胞移入。同时将原培养液换为不
7、含葡萄糖的DMEM液(Gibco产品)缺糖缺氧1.5h。然后将无糖DMEM液重新换为原培养液。同时添加不同神经保护剂，将细胞重新置于5％CO2、95％空气、37℃的培养箱内复灌24h后进行DAPI染色。 1.6细胞免疫荧光染色染色前细胞密度调整到0.8×105/孔（24孔板）。染色当日移去完全培养基，用预热至35℃的PBS洗1次，用4%的多聚甲醛固定20min。然后PBS洗3次，用含0.5％TritonX-100的PBS在室温通透化处理15min，PBS洗3次，用含10％羊血清的PBS封闭3h以上，室温下一抗孵育1h以上，用含0.1％Tpus）及激光共聚
8、焦显微镜（Leica）观察，绿色荧光以494nm入射光激发，518
