培养不同时间大鼠皮质在缺糖缺氧损伤中神经元凋亡的

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1、培养不同时间大鼠皮质在缺糖缺氧损伤中神经元凋亡的【摘要】目的观察培养不同时间的大鼠脑皮质神经元对缺糖缺氧的敏感程度,探讨培养时间在皮质神经元损伤中的作用。方法首先分离孕18天胎鼠的皮质神经元，分为对照组和实验组。实验组于培养6天、8天、12天时分别进行缺糖缺氧（OGD）2h，然后培养24h；采用DAPI染色﹐荧光显微镜下观察细胞的形态变化。对照组除不进行OGD的损伤外，其他条件与实验组一致。结果培养12天较培养8天的皮质神经元细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.05);培养6天的皮质神经元的细胞凋亡率与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论不同培养时间

2、的皮质神经元对OGD损伤反应不同；未成熟的皮质神经元对OGD不敏感,具有耐受性;成熟的皮质神经元随成熟程度的增加，对OGD敏感性增强。【关键词】皮质神经元缺糖缺氧凋亡大鼠Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofculturetimeontheapoptosisoffetalratcorticalneuronsinducedbyoxygenandglucosedeprivation(OGD).MethodsThecorticalneuronsseparatedform18-dayfetusratmature,groediumediumto

3、continuetheculturefor24hours．Theapoptosisethodaturityoftheculturedcorticalneurons.Theimmatureneuronsareinsensitiveandtoleranttolackofoxygen,andthesensitivityincreases,S)损伤修复参与的因子比较多，其中凋亡是S损伤修复过程中一个重要的手段。不同发育期的细胞，其凋亡的情况也不同。初步的研究结果提示，成熟的细胞或衰老的细胞对损伤反应更敏感，容易凋亡，从而保护机体健康的细胞；而未成熟的细胞或活力强的细胞则可能对损伤有一定的

4、耐受性。皮质神经元对学习、记忆有很重要的作用，其受损伤后经常会表现痴呆和记忆丧失，这在缺血性脑卒中和老年痴呆症患者中表现最为明显。随着中国甚至世界社会老龄化的到来，老年病的研究将势在必行。关于不同年龄段的皮质神经元对缺糖缺氧（oxygenandglucosedeprivation,OGD）损伤的研究，国内外少见研究报道。本实验研究通过特殊的培养基体外培养大鼠脑皮质神经元，在培养的不同时间段（即体外模拟不同年龄段的皮质神经元）制作细胞OGD损伤模型,模拟在体的“缺氧缺血”状态，观察不同时间段的皮质神经元对OGD的反应。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物孕18天Sprague-

5、Daidine-2-phenylindole,DAPI)、联苯二胺为美国Sigma公司产品，其余试剂为国产分析纯。1.2方法采用分组对比的方法，将培养的皮质神经元分为对照组和实验组进行研究观察。具体方法如下。1.2.1皮质神经元的体外培养按将培养不同时间经OGD后又培养24h的实验组和相应时点的对照组的皮质神经元，用PBS溶液轻洗2次，4%多聚甲醛（溶于0.1mol/LPB，pH7.4）室温固定15min后，再次用PBS溶液轻洗2次，加入10mg/LDAPI（用含0.2%Triton的PBS溶解），37℃孵育30min。在Olympus荧光显微镜上，以400nm为激发光，455n

6、m发射光观察。细胞发生凋亡的判定方法为：细胞的胞核边缘不规则，细胞核染色体浓集，着色较重，并伴有细胞核固缩和细胞核碎片增加现象。凋亡率(AI)的计算方法为：400倍下每孔中随机选取10个视野，计算视野中凋亡细胞占总细胞数的百分率，求均值。1.3统计学处理每组4个样本，分别来自于4批独立培养的细胞。所有实验数据以±s表示；统计方法采用方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对照组的比较采用LSD法（leastsignificantdifference），各实验组间的两两比较采用q检验（Nean-Keulstest）;P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1培养不同时间神

7、经元生长状态倒置相差显微镜下观察。接种30min后神经元基本贴壁，多呈圆形，个别细胞开始伸出突起；24h胞体形态开始分化，有锥体状、卵圆状等，有较强折光性和立体感，突起分支细长，而且开始有成簇聚集倾向；第5天胞体渐增大，突起伸长并交织成网；第8天细胞呈簇状分布，突起丰富，粗而长，相互交织成网状；第18天的神经细胞数量减少。相对于对照组的皮质神经元,经OGD后的皮质神经元细胞有轻微的脱壁现象,少数细胞完整性遭到破坏,折光性降低,立体感遭到破坏,有些突起消失；随着培养时间的增加，培养