TRPC在SNP诱导海马神经元凋亡中作用及机制的初步研究

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1、硕士学位论文TRPC在SNP诱导海马神经元凋亡中作用及机制的初步研究硕士研究生：张贺指导教师：邹飞教授摘要研究背景一氧化氮(Nitricoxide，NO)在神经系统中广泛存在，无论在生理状态或病理状态下，都是一个重要的信号分子【¨。生理状态下低浓度NO可促进细胞增殖、分化等，而高浓度则导致细胞凋亡甚至坏死【21。在脑缺血缺氧损伤，氧化应激等条件下，脑内过量的NO表现出明显的细胞毒性【31。研究发现，NO通过阻断线粒体氧化呼吸链、直接损伤DNA或启动内质网应激反应来诱导凋亡【4，5一。以往神经元损伤

2、研究已证实：细胞内钙离子在上述通路中均起重要作用啊。近年来，TRPC离子通道作为一类可调节细胞内钙浓度非特异性阳离子通道【引，其功能研究受到了广泛关注。研究已表明，NO可激活TRPC离子通道并提高胞内钙离子浓度【9,10]。但TRPC离子通道是否因此参与NO诱导的神经元凋亡呢?本研究以体外原代培养海马神经元为研究对象，对TRPC是否参与NO诱导的神经元凋亡及其机制进行初步探讨，以期为神经损伤的防治研究提供新线索。目的本研究通过SNP自发释放NO，诱导原代培养海马神经元凋亡，在此模型基础上初步探讨T

3、RPC在凋亡中的作用及其机制，以期为神经损伤的防治研究提供新思路。摘要方法原代培养的海马神经元作为空白对照组，实验组分为三组，分别为原代培养的神经元中加入SNP，SNP+TRPC通道阻断剂组；SNP+TRPC通道激活剂组。细胞处理24h后MTT比色法检测各组细胞存活率，Hoechest33342荧光染色观察细胞凋亡。采用Trizol提取细胞中的总RNA，RT-PCR检测TRPC在海马神经元上的表达情况，real．timeRT-PCR实验检测TRPCI以及凋亡相关基因mRNA水平的表达变化。结果l原

4、代海马神经元的培养及鉴定，通过RT-PCR检测TRPCI．6，发现所有的TRPC亚型在海马神经元均有表达。，．2①SNP(1raM)处理24小时，神经元存活率为67．4％；与空白对照组有显著差异(P

5、对神经元存活率没有影响(P加．05)。②各组细胞处理后，Hoechst33342染色，荧光显微镜下观察，空白对照组神经元胞核均匀蓝染；SNP处理组神经元胞核明显固缩、凝聚，可见高亮蓝染的凋亡小体；SNP+1RPC激动剂组凋亡细胞明显增多；而SNP+TRPC阻断剂组神经元胞核均匀蓝染，细胞无凋亡小体等凋亡特有的形态学变化。3给予SNP处理24小时后，通过real．timeRT-PCR检测TRPCI的表达变化，发现SNP处理并不影响TRPCImRNA在水平上的表达(胗O．05，n_6)。4通过real

6、．timeRT-PCR检测p53下游基因的表达变化，确认SNP诱导的海马神经元凋亡的p53下游信号分子。结果显示SNP处理神经元4h、8h、24h后，p53下游靶基因Bax，Apaf-1和survivin表达无明显变化pO．05)。而PUMA则在三个时间点分别增加至1．95，1．82和1．96倍，与对照组相比有统计学意义(P

7、代培养的海马神经元上均有表达，可通过调节PUMA表达参与SNP诱导的原代培养海马神经元凋亡。关键词：海马神经元，凋亡，一氧化氮，TRPC．PUMAⅡI硕士学位论文RoleandmechanismofTRPCinhippocam-·palneuronsapoptosisinducedbySNPName：ZhangHeSupervisior：Prof．ZouFeiABSTRACTBackgroundNitricoxide(No)widelyexistsinneuronalsystemwhichplay

8、saveryimportantroleinsignaltransduetioninbothphysiologicalandpathologicalconditions．Undernormalconditions，NOappearstobeanimportantphysiologicalsignalingmolecule．Itisabletopromotecellproliferationanddifferentiation，buttoomuchNOmaycauseneurons’a