高温对体外培养海马神经元细胞的影响及细胞凋亡机制研究

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1、高温对体外培养海马神经元细胞的影响及细胞凋亡机制研究　　[摘要]目的：研究不同温度对体外培养海马神经元细胞的影响及其机制。方法：取出生1～3天的SD幼鼠海马神经细胞体外培养，分为37℃和42℃2组，分别孵育12h和24h。利用CCK8、TUNEL分析、Westernblot等技术，观察12h和24h时海马神经细胞存活率及凋亡细胞数，以及Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白表达。结果：与37℃组相比、42℃组海马神经元细胞存活率下降，凋亡阳性细胞数明显增加，并随着时间延长凋亡阳性细胞数增多。42℃组中，神经元细胞Bcl-2表达减弱，Bax、cleaved-cas

2、pase3表达增强，上述指标与37℃组同时点比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：高温可以诱导体外培养海马神经元细胞凋亡，可能通过PI3K/Akt信号传导通路诱导神经细胞凋亡。　　[关键词]高温；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；caspase3　　中图分类号：R741.02文献标识码：A文章编号：2095-5200（2017）01-082-03　　DOI：10.11876/mimt201701033　　高温是一种常见职业病危害因素。文献报道长期处于高温环境可引起人记忆力及认知能力下降[1]。海马作为大脑边缘叶的重要组成部分，与认知功能有密切关系，是影响学习和记忆功能的重要

3、脑区[2]。本实验建立高温致体外培养海马神经元细胞凋亡模型，用免疫印迹法对海马神经元细胞的凋亡相关基因Bcl-2、Bax和活化的caspase3蛋白表达进行半定量观察，探讨高温对海马神经元细胞影响及细胞凋亡发生机制。　　1材料和方法　　1.1实验动物　　10只SPF级健康SD乳鼠，出生1～3天，雌雄不限（山东大学动物实验中心）。　　1.2仪器和试剂　　二氧化碳培养箱、恒温水浴加热器、mini-PROTEAN电泳装置、DMEM培养基，胎牛血清（购自杭州四季青公司），CCK8试剂盒（碧云天），TUNEL试剂盒（罗氏），DAB显色试剂盒（碧云天），兔Bcl-2一抗、兔Bax一抗、兔cl

4、eaved-caspase3一抗（武汉三鹰）。　　1.3方法　　1.3.1细胞分组和处理海马神经细胞的原代培养采用文献[3]方法。分为2组，每组3个样本，于接种后6d将盛有细胞悬液的离心管分别置于37℃、42℃恒温水浴箱，2组分别在处理12h、24h两个时点测定各项指标，测定重复3次，取平均值。　　1.3.2CCK8检测细胞存活率在96孔板中接种细胞悬液，按上述方法分组培养后，向每孔加入10μLCCK8溶液，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。每组设6个复孔，重复3次。　　1.3.3TUNEL检测细胞凋亡将细胞接种于含有盖玻片的6孔板内，使细胞爬片。按照上述方法分组培养后，进行固

5、定、洗涤、加反应液、孵育等处理，加入DAB显色液，室温孵育3min镜下观察。单盲法手工计数20个不同视野（200倍显微镜）下TUNEL阳性细胞数，取平均值，计算凋亡细胞百分率。　　1.3.4Westernblot检测Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白表达分组处理后，将50μg变性蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，转膜上。室温封闭1h，分别加相应一抗及GAPDH内参，4℃摇床孵育过夜。第2天二抗室温孵育1h，ECL反??，经LAS-4000mini型发光成像分析仪曝光显影。用quantityone分析软件对各组条带进行分析，将各组的整合灰度比例与内参（GAP

6、DH）比较，并以GAPDH的ID为100%，得到相对百分数（即ID/内参ID×100%）。　　1.4统计学分析　　数据均以均数±标准差（mean±SD）表示，所得数据均采用SPSS13.0统计软件进行分析。2组之间均数的比较采用单因素方差分析及Bonferroni法，以P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1不同温度对海马神经细胞存活率的影响　　37℃组12h/24h海马神经细胞平均存活率为99.43%、71.33%，42℃组12h/24h海马神经细胞平均存活率为93.28%、60.88%，42℃组低于同时点37℃组细胞存活率，12h2组间比较P=0.002，24h2

7、组间比较P=0.005，差异均有显著统计学意义。　　2.2不同温度对海马神经细胞凋亡率影响及细胞形态改变　　37℃组12h/24h海马神经细胞平均凋亡率为1.23%、5.67%，42℃组12h/24h海马神经细胞平均凋亡率为51.67%、68.36%，42℃组高于同时点37℃组细胞凋亡率，12h2组间比较P=0.0022，24h2组间比较P=0.034，差异均有统计学意义。凋亡细胞镜下可见染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质凝聚、分块，胞质皱缩，核呈圆形或新月形，有的核外周深染而