神经元样细胞对体外培养成肌干细胞功能活性的影响

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文神经元样细胞对体外培养成肌干细胞功能活性的影响Theeffectsofneuron-·likecellsontheactivityofC2C12cellsinvitro课题来源：国家自然科学基金面上项目(编号：30771014)国家自然科学基金面上项目(编号：81171724)专业名称人体解剖与组织胚胎学学位申请人刘幸卉指导教师廖华教授答辩委员会主席答辩委员会成员汪华侨教授吴增晖教授张琳教授欧阳钧教授张美超副教授论文评阅人郭家松教授田雪梅教授2012年05月20日广州硕士学位论文神经元样细胞对

2、体外培养成肌干细胞功能活性的影响硕士研究生：刘幸卉指导教师：廖华教授摘要骨骼肌组织工程的建立为各种骨骼肌疾病(肌营养不良、脊髓性肌萎缩等)提供了治疗希望，也使整形外科治疗创伤、肿瘤切除、失神经支配所致的肌组织缺失进行外科重建成为可能【I捌，许多学者致力于骨骼肌的体外构建和替代研究，试图创建功能化的肌组织。经过多年的探索和努力，一些权威的研究组取得了相当的成绩，不断推进骨骼肌组织工程的研究进展：Powelll3,41等采用胶原和基质成功构建三维骨骼肌组织，并对构建组织施加机械刺激，确保体外培养肌组织的形成、分化和收缩功能形成；D

3、ennis和Kosnik[5,6]则探索出三维骨骼肌组织的自组装模式，作者称其构建肌组织为Myooids，在横向电刺激时具有持续的兴奋性和收缩功能。德国的Bach研究组进行了成肌细胞与纤维蛋白三维支架的复合培养，获得了具有极性分化功能的多核肌管【7’8】。然而，体外条件下进行骨骼肌组织的构建仍面对诸多挑战，尤其在神经化方面。在体研究肌肉的神经支配十分困难，目前研究人员一般采用将成肌细胞与神经元细胞体外共培养来研究成肌细胞与神经细胞的相互作用，并取得了一系列进展。比较经典的是从动物胚胎的脊髓获取神经元细胞进行纯化，然后共培养。W

4、agner[9】共培养小鼠成肌细胞和胚胎大鼠脊髓，发现共培养组的分化肌管表达更高密度的乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor。AchRs)，肌管具有更强的导电能力。Das[10l等将大鼠的神经细胞和肌细胞直接联合培养，发现两者之间形成了神经肌肉接头。神摘要经末梢及各种神经递质的缺乏不利于分化肌管的长期存活和收缩功能的维持，在体外条件下成肌细胞与外周神经元的相关性是构建神经化骨骼肌组织的关键因素。上述研究明确了神经元细胞对成肌干细胞的生物学影响，但由于原代分离培养的神经元细胞对体外生存环境要求较高，体外成肌细胞

5、的存活、增殖及分化环境很难同时满足原代分离神经元的生长要求，为体外骨骼肌组织工程构建的开展带来一定困难。PCI2细胞是褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系起源于神经嵴，易获得，便于体外培养，细胞增殖能力强，表达神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)受体TrI(A和p75NTR，因此NGF能与其受体结合使ras／raf／MEK／ERK信号通路活化【11-131，使其停止增殖，细胞表型发生明显改变，获得神经元特性，如长出细胞突起、形成突触样结构、具有电兴奋特性等。PCI2细胞未分化时合成儿茶酚胺，在NGF的作用下可以合

6、成乙酰胆碱并且长出神经突结构【141。广泛应用于神经系统疾病的体外研究。周涛【15】等的研究表明，PCI2细胞能与原代神经元之间形成突触连接，JEON[16】等发现NGF诱导分化的PCI2细胞之间可以形成突触样结构。王静【17】等将诱导分化的PCI2细胞与心肌细胞共培养，发现PCI2细胞可作为体外再造心肌神经支配研究模型的供体细胞。Glass[1e】等的研究发现骨骼肌纤维与PCI2细胞共培养时，肌肉细胞中的慢肌球蛋白轻链2的合成水平增高。Defez[19】等也证实TPCI2细胞可以影响骨骼肌的分化进程。有关PCI2细胞与C2C

7、12细胞的体外共培养及相互的功能影响，目前尚未发现相关的文献报道。鉴于上述研究背景，本研究尝试将已经分化的PCI2细胞与成肌细胞进行共培养，观察其对成肌细胞是否具有支配关系，为构建组织工程骨骼肌提供一种新的方法和思路。Ⅱ硕士学位论文我们的主要研究内容第一章PCI2细胞的分化培养及鉴定【目的】：，用NGF对PCI2细胞的诱导分化，通过免疫荧光染色观察NGF对PCI2细胞的诱导分化作用。【方法】PCI2细胞常规复苏后用含100U／mL的青霉素、1001-Lg／mL的链霉素和10％胎牛血清的DMEM／F12完全培养基，种植于培养瓶内

8、，37℃5％C02培养箱中培养将培养生长状态良好的PCI2细胞按2×104／mL密度接种于预先置有小盖玻片的6孔板中，待细胞达到80．90％后，加入浓度为50ug／LNGF的DMEM／F12培养基对PCI2细胞进行诱导分化培养，1d换液，相差显微镜下观察PCI2细胞形态。分别