银杏叶提取物对大鼠神经干细胞分化为神经元样细胞的影响

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1、银杏叶提取物对大鼠神经干细胞分化为神经元样细胞的影响：李晓涛路来金李艳君解云川【摘要】目的观察银杏叶提取物（EGB）对大鼠海马神经干细胞（NSCs）增殖及分化为神经元样细胞的影响。方法取新生24h内的EM/F12培养液，置于培养箱中培养。⑤培养条件：37℃、5%CO2、80%湿度，每3d换1/2液体，第7天开始传代。　　1.2EGB诱导NSCs的分化及鉴定　　①将上述培养形成的NSCs团，离心，弃上清液，然后在离心管重新加入培养液，再用吸管吹打成单细胞悬液后，接种至3块24孔培养板中，培养板的各孔中均预先放置一块经多聚赖氨酸(50μg/ml)涂布的盖玻片。②将24孔培养板分为4组：对照组（培养

2、液为含2%B27的DMEM/F12）、EGB10、20、40μg/ml组（2%B27的DMEM/F12分别加入不同浓度EGB），平均每组6孔，将培养板置于培养箱中。于培养时间7、14、21d分别对盖玻片上贴壁细胞进行ABC免疫酶标技术DAB显色。在10×25相差显微镜下，随机选取4个视野，计数阳性细胞数、细胞总数和阳性细胞百分数。　　1.3统计学分析　　数据用x±s表示，采用SAS统计学软件进行方差分析和q检验。　　3讨论本实验采用含2%B27的DMEM/F12作为基础培养基，并向其中加入EGF和bFGF这两种细胞有丝分裂中重要的生长因子，其主要作用是促进细胞有丝分裂，抑制细胞分化。如果培养

3、基中不加入生长因子或者生长因子浓度过低，细胞悬浮生长一段时间，然后逐渐衰老死亡。EGF和bFGF在哺乳动物胚胎时期神经系统发育的各个阶段，都能促进细胞分裂、增殖，并且bFGF能促进EGF反应性细胞表达，二者产生协同效应。EGF和bFGF对NSCs的作用还与其浓度有关。有实验证实：二者均在20ng/ml左右时，其促进细胞分裂的效应最强。因此本实验中，在细胞的原代培养时，在培养基中加入EGF和bFGF，浓度均为20ng/ml。结果7d时观察到培养基中形成大量的NSCs球，这与先前报道的结果一致〔2〕。7d后，当细胞增殖达到一定数量，在24孔培养板中贴壁培养时，在培养孔中加入不含EGF和bFGF的基

4、础培养液，此时细胞虽然在数量上有所减少，生存周期有所缩短，但这样能排除EGF和bFGF对NSCs分化的干扰，能比较客观地反映EGB对NSCs分化的影响。NSCs定向分化与其所处的微环境关系密切〔3〕。本实验利用ABC免疫酶标DAB显色法鉴定NSCs的定向分化，结果表明EGB能够促进NSCs分化。但促进NSCs向神经元样细胞分化的最佳浓度要在以后的实验中探索。不同的时间内，相同浓度EGB促NSCs分化的结果比较发现：EGB诱导NSCs分化为神经元样细胞的百分率，随时间延长，有下降趋势。这提示神经细胞在发育的过程中，对微环境中营养因子、促分化因子的需求不同，或者与神经元分化的内在因素有关。EGB

5、促进NSCs增殖及分化的可能机制包括：①EGB对神经细胞凋亡的抑制作用：EGB具有增强神经细胞活性，保护神经细胞染色体，使其免于断裂，而发挥抗细胞凋亡的作用，由此将延长细胞的存活时间。②EGB通过对血小板活化因子（PAF）的拮抗作用：抑制兴奋性氨基酸的释放，防止细胞内钙离子的异常增高及蛋白酶C被激活，进而降低cfoc及cfun表达，避免细胞受到损害。③EGB发挥抗氧化的作用：通过改变NSCs内氧化还原状态，加强线粒体氧化磷酸化能力，促进NSCs能量代谢，使其分化为NSE阳性细胞。④直接进入NSCs内或者与NSCs膜上的受体结合，然后激活Ngn1、Ngn2、Mash1等转录调控因子〔4〕，进

6、而促使NSCs向神经元样细胞方向分化。【参考文献】　1ReynoldsBA，engXT,etal.Biologicaleffectofvelvetantlerpolypeptidesonneuralstemcellsfromembryonicratbrain〔J〕.ChinMedJ，2005;118(1)：3842.　　4LinM，YangL，FuR,etal.Cloningoftheeukaryoticexpressionvectoresencephalneuralstemcellsoffetalrats〔J〕.JHuazhongUnivSciTechnol(MedSci)，2008；28

7、(5)：5136.