rnai沉默vegf表达对大肠癌细胞肝转移的影响

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1、RNAi沉默VEGF表达对大肠癌细胞肝转移的影响：王崇强，范钰，徐永中，庞利群【摘要】目的：研究血管内皮生长因子（vascularendothelialgroRNA设计合成小干扰RNA，采用荧光实时定量PCR检测VEGFmRNA水平，分别以软琼脂集落培养试验和Boyden模型观察癌细胞锚着不依赖性增殖和癌细胞侵袭能力。以脾切除法建立大肠癌肝转移模型，以不同方法处理的癌细胞接种模型，观察对大肠癌细胞肝转移的影响。结果：转染组VEGF基因mRNA水平明显降低，且呈浓度和时间依赖性。经VEGFsiRNA转染处理的癌细胞软琼脂集落形成数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性（P<

2、0.05，P<0.05）。体内试验发现，对照组10只全部出现大肠癌肝转移灶，而siRNA组仅仅1只出现肝转移，差异具有显著统计学意义（P<0.01）。结论：VEGF基因在大肠癌肝转移中起着重要的作用；以RNAi技术沉默VEGF基因表达，可抑制大肠癌细胞肝转移。【关键词】肠肿瘤；　肝转移；血管内皮生长因子；RNA干扰　　［Abstract］Objective:Tostudytheeffectsofvascularendothelialgroetastasisofcoloncancer.Methods：AfterhumancoloncancercelllineLS17

3、4TallinterferingRNA（siRNA）,themRNAlevelinedbyrealtimeRTPCR.Theanchorageindependentgroinedusingcloneformationinsoftagar,andinvasionabilitybermodel.Thirtynudemicemodelofcolorectalcancerlivermetastasisy.Results：VEGFsiRNAcaninhibitanchorageindependentgroetastasisofcoloncancerinvivo.Conclusio

4、n：VEGFsiRNAcaninhibitlivermetastasisofcoloncancer.　　［Keya；livermetastasis；　vascularendothelialgroallinterferingRNA，siRNA）介导的RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术，采用VEGF基因siRNA转染处理大肠癌细胞LS174T，从体内外观察了对癌细胞侵袭和肝转移的影响。现报告如下。　　1材料与方法　　1.1材料　　人大肠癌低分化腺癌细胞株LS174T由中国科学院上海细胞所细胞库从美国ATCC引进并提供，肿瘤细胞常规在含体积分数为10%胎

5、牛血清RPMI1640培养液中培养。针对VEGFsiRNA的正义链为：5′GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT3′。错配siRNA序列（正义链：5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd3′；反义链：5′ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT3′）。均由美国Dharmacon公司合成。Trizol,RNaseinhibitor、反转录酶SSRTⅡ,Taq酶和转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。Balb/c裸鼠，30只，雌性，4周龄，体质量约14～18g，购自中国科学院上海生物化学研究所，于无特殊病原体条

6、件(SPF)下饲养。　　1.2细胞培养及转染处理　　大肠癌LS174T细胞在含10％胎牛血清的RBMI1640培养液，37℃,5％CO2、饱和湿度条件下连续培养。转染前1天，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1ml/孔，培养过夜。次日进行转染。基本操作按说明书进行。分组：(1)空白对照组(ConA)，即未经任何处理的癌细胞；(2)空载对照组(ConB)，即单一用脂质体处理的对照组；(3)错配对照组(ScrRNA)；(4)siRNA转染组：含10％胎牛血清的RBMI1640中含的已用脂质体包埋的siRNA(3.125,6.25和12.5nmol/L

7、)。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行以下试验。　　1.3实时定量RTPCR检测VEGFmRNA水平　　收集细胞，以Trizol抽提细胞总RNA，取总RNA1μg，以oligodT（15mer）为引物反转录合成cDNA第一链，取此cDNA链2μl为模板进行PCR扩增。以3磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为内参。扩增步骤及PCR结果分析参照文献［6］进行。VEGF引物序列为：上游：5′GCCTTGCCTTGCTGCTCTAC3′；下游：5′TTCTGCCCTCCTCCTTCTGC3′