sirna沉默hif1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞vegf表达的影响论文

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1、siRNA沉默HIF1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响论文吴欣爱，孙燕，樊青霞，王留兴，王瑞林，赵培荣，张岚【摘要】目的观察体外乏氧培养条件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF1α和VEGF的表达，探讨HIF1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用。方法CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境.freelRNA和蛋白水平的表达。采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术（RNAi）用siRNA转染EC9706细胞。观察转染后HIF1α沉默效果。结果低氧条件下，EC9706细胞HIF1αmRNA水平稳定，蛋白表达显著

2、升高，而VEGFmRNA和蛋白的表达均显著升高。SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF1α的基因表达，同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论缺氧促使EC9706细胞HIF1α在蛋白水平表达升高，并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成。【关键词】食管鳞癌;乏氧诱导因子1α;血管内皮生长因子;双链RNA;RNA干扰恶性肿瘤快速生长和肿瘤内部血液供应相对不足导致肿瘤内部形成缺氧微环境。低氧是实体肿瘤微环境的基本特征之一。缺氧条件下，肿瘤细胞内许多基因的转录和表达发生变化，对缺氧作出应激反应。引起肿瘤的侵袭性增加和对放化疗的抗拒性增加

3、，而在这个过程中转录因子乏氧诱导因子1（hypoxiainduciblefactor1alpha,HIF1α）起中枢纽带作用1。乏氧引起的一些酶或因子的变化大多是通过HIF1α起作用。其在食管癌血管生成中的调控作用，尚未见详细报道。本研究以食管鳞癌细胞系EC9706为研究对象，通过体外模拟肿瘤缺氧微环境，利用RNA干扰技术观察小干扰RNA转染EC9706细胞前后低氧条件下HIF1α和VEGF的表达，初步探讨HIF1α在缺氧条件下对食管癌血管生成的调控作用。1材料和方法1.1材料食管鳞癌细胞系EC9706由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家

4、重点实验王明荣教授惠赠。HIF1αsiRNA(h)、ControlsiRNAA、siRNA转染试剂及HIF1α抗体均购自SantaCruz公司。RTPCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，VEGF抗体购自武汉博士德公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术公司1.2方法1.2.1细胞体外乏氧培养条件的建立EC9706细胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。化学缺氧剂CoCl2加入培养基的终浓度为75μmol/L，用于模拟肿瘤内部缺氧微环境。1.2.2半定量RTPCR检测mRNA表达EC9706细胞于

5、低氧条件下培养8h，Trizol法提取细胞总RNA，逆转录反应体系（20μl）组成为：DEPC水7μl，5×Buffer4μl，dNTPs（10nM）2μl，Oligo（dT）1μl，RNase抑制剂1μl，总RNA4μl，逆转录酶1μl，37℃5min，42℃1h，70℃10min灭活逆转录酶。PCR引物序列如下：HIF1α上游5′CCTGCACTCAATCAAGAAGTTGC3′，下游5′TTCCTGCTCTGTTTGGTGAGGCT3′（618bp）；VEGF上游5′CACATAGGAGAGATGAGC3′，下游5′CCGCCTCG

6、GCTTGTCACA3′（230bp）；βactin上游5’CATCCTGCGTCTGACCT3’,下游5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’(480bp)。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，数码照相并行灰度值分析。1.2.3免疫组化SP法检测低氧条件下HIF1、VEGF蛋白的表达缺氧处理8h后收获细胞爬片，4%多聚甲醛固定10min，按照试剂盒说明进行。HIF1α、VEGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，SP试剂盒购自中杉生物技术有限公司。1.2.4siRNA转染EC9706细胞转染前24h以4×105/ml密度接

7、种细胞于6孔培养板，待细胞生长至60%～70%融合时进行转染。按试剂盒说明进行。分别设siRNA转染组及ControlsiRNA组。转染32h后，更换含化学缺氧剂CoCl2培养基继续培养8h，收集细胞进行相关指标检测。1.2.5HIF1α基因沉默效果的测定低氧培养4、8h后，分别提取未转染组、转染阴性对照组和转染组的细胞蛋白考马斯亮蓝蛋白定量。10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，380V转移30min，凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入HIF1α抗（1∶1000稀释），37℃孵育2h，PBS漂洗，在封闭液中加入

8、辣根酶标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗。最后用ECLPLUS试剂孵