rna干扰沉默食管鳞癌细胞hif1α基因对血管生成拟态相关基因表达的影响

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1、南窳医科大学硕士学饶论文英文缩略词表HIF—lahypoxiainduciblefactor-la缺氧诱导因子一l伐ESCCesophagealsquamouscancerous食管鳞癌细胞cellEphA2epithelialcellkinase上皮细胞激酶VE．cadhednvascularendothelialcadherin血管上皮钙粘附素LN-572laminin一5gamma-2chain层粘连蛋白5r2链N啪．2matrixmetalloproteinase一2基质金属蛋白酶，2VMvasculogenicmimicry血管生成拟态HREhypoxia-respo

2、nseelement缺氧反应元件Ⅳ氏∞microvasculardensity锱血管密度RBPCRreversetranslation-polymerase逆转录聚合酶链反chainreaction应RNAiRNAinterferenceRNA干扰sbRNAshorthairpinRNA短发夹RNASiRNAsmallinterferenceRNA小干扰RNA一2一南京医科大学硕士学位论文论文独创性声明本论文墅坠主垫婆丛盒萱鐾疸麴照跫兰至：堇堡基因壁垒釜生盛垫查趣基基鸯盘姿鳢受煎是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他

3、人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。专业l内銎鲎f滥垡2作者签名：窒曼2日期：劾趟氢缒五论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阕；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文备保密的论文在解密焉遵守此规定。作者签名：啦导师签名：瞒型-■南索医科大学顼士学位论文RNA干扰沉默食管鳞癌细胞HIF．1a基因对血管生成拟态相关基因表达的影响硕士研究生：华杰导师：施瑞华教授中文摘要霉的：利用RNA干扰技术

4、沉默HIF．1a基因，构建稳定表迭沉默HIF．1a的食管鳞癌Eca-109细胞株，分别常氧、缺氧条件下研究RNA干扰对人食管鳞癌细胞Eca-109中HIF．1a基因及血管生成拟态相关基因的抑制效应。方法：1、用不同缺氧时间(0、12、24、36、48、60、72、96h)分别缺氧培养食管鳞癌细胞Eta-109(缺氧培养箱中混合气体浓度为5％c02、85％N2、10％H2)，以Westernblotting法检测细胞中HIF．1a蛋白的表达变化，选择可以荸l起HIF．1a蛋白表达增加的适当的缺氧培养晴闻。2、选择四组细胞进行培养：1组为食管鳞癌细胞Eca．109，2~4组为RNA

5、干扰HIF。la基因后筛选毒的稳定传代的3株细胞(分别为H2／20、H3／10、H3／15号细胞，由本实验室编号保存)，采用缺氧培养24h，以Westernblotting和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF—la蛋白及mRNA表达，同时Westernblotting检测上皮细胞激酶·3．南索医科大学硕士学位论文(EphA2)、血管上皮钙粘附素(VE．cadherin)、基质金属蛋白酶一2(MMP．2)、层粘连蛋白572链(LN-Sr2)等血管生成拟态相关基因的表达。结果：一，I-IIF—lamRNA及蛋白的表达在常氧和缺氧不圈时间点检测Ecal09细胞HIF—la的

6、表达，发现HIF．1amRNA表达无明显差异(P>0．05)(图一、二)。Ecal09细胞和干扰处理姆各组细胞在常氧争缺氧培养2碡小时后检测，各组细胞HIF。lamRNA表达无明显差异(P>0．05)(图三、四)。在Eca。109细胞中HIF．1a蛋白表达在缺氧处理时较常氧培养时增加，在缺氧后24．48h明显升高，60h略有降低，72．96h逐渐减少(图五)。3组RNA干扰的细胞常氧下HIF．1a蛋白表达被明显抑制，且在缺氧处理后亦无明显递增趋势(图六)。二、血管生成拟态相关基因的表达干扰细胞常氧下EphA2、LN5v2表达比未干扰的Eca-109细胞明显减少，缺氧处理24h后

7、亦无明显增加(图七)；VE。cadherin、MMP．2表达较泰干扰细胞略减少，缺氧处理后表达稍增强(P>0。05)(图八、九、十)。结论：1、HIF．1a蛋白表迭与缺氧时间有关，HIF。lamRNA表达没有明显差异，提示缺氧诱导的HIF．1a调节可能发生在蛋白水平，而非转录水平。南京医科大学硕士学位论文2、所选3株细胞干扰效率均较高，干扰后HIF．1a蛋白表达明显抑制，且缺氧后亦无明显增强。说明RNA干扰作为一种特异性基因沉默技术，具有更好的稳定性和更优越的抑制效果，是基因功能研究的得力工