rna干扰技术沉默血管内皮生长因子cvegfc基因对食管癌的防治作用

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1、山东大学博士学位论文RNA干扰技术沉默血管内皮生长因子一C(VEGF—C)基因对食管癌的防治作用博士研究生：王晓航导专师：陈景寒教授业：胸外科中文摘要研究背景及目的：食管癌是我国的高发癌种，死亡率高，居于我国恶性肿瘤死亡率的第4位，其分布有明显的地域性，山东省是我国食管癌高发区之一。食管癌与其他消化道肿瘤一样呈高侵袭性生长，并且容易发生扩散转移。血管生成(angiogenesis)存在于许多生理和病理过程中，它既可参与胚胎发生、创伤修复、女性生殖周期等生理过程，又是炎症反应、类风湿性关节炎、糖尿病、视网膜

2、病、肿瘤等病理过程中的重要环节。近年来研究发现血管生成对实体肿瘤的生长、进展、转移的作用尤为重要。实验研究表明，抗血管新生治疗可以抑制肿瘤的生长，降低其复发、转移的能力⋯。血管生成是一个多因素参加的协同作用过程，受多种因子的调控。血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)是最主要的促血管生成因子，在血管生成过程中发挥着重要的作用。血管内皮生长因子在肝癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等中的作用已经得到证实‘4‘151，而其对食管癌生物学行为的影响方面文献报告不

3、多。RNAi是指双链RNA(dsRNA)进入细胞后特异性阻断与其同源的基因表达的现象。它是当前研究基因功能的重要工具，而且已有人将其用于肿瘤、病毒感染基因治疗的研究。用慢病毒(Lentivirus)做载体介导RNAi用于基因治疗的研究更有实际应用潜力，因为与其它病毒载体系统相比，慢病毒能转导非分裂(Non—dividing)细胞并将shRNA表达结构整合到宿主细胞基因组，实现目的基因的稳定沉默。本文从蛋白水平研究VEGF．C基因在食管癌中的表达，观察其与临床病理山东大学博士学位论文学指标的关系；我们用RN

4、A干扰技术破坏VEGF．CmRNA，使VEGF．C蛋白的合成处在极低的水平，降低VEGF．C积聚及对下游基因的转录调控，能够在很大程度上阻断肿瘤细胞的应答，建立一种基因修饰食管癌治疗策略，提高食管癌的治疗效果，为探讨以VEGF—C为靶标建立食管癌早期诊断和基因治疗方法提供理论依据和技术对策。第一部分VEGF．C基因在食管癌组织中表达水平的研究【方法】：选取山东大学附属省立医院胸外科1998～2001年手术切除的食管鳞状细胞癌标本46例。男性36例，女性10例；年龄30岁～74岁，中位年龄56岁；根据组织学

5、分级：I级8例，II级28例，III级10例；根据浸润深度分为三组：侵及黏膜固有层或黏膜下层2例，侵及肌层21例，侵及纤维外膜22例，侵及胸主动脉1例；区域淋巴结：有转移14例，无转移32例；根据UICC1997年分期标准，I期2例，IIa期31例，IIb期5例，III期8例。所有病例均随访5年以上。术前均未行放、化疗。免疫组化按武汉博士德生物公司SABC免疫组化染色试剂盒说明书操作，兔抗人VEGF—C多克隆抗体(工作浓度1：50)、兔抗人F8因子相关抗原抗体(工作浓度1：200)。VEGF．C阳性表达判

6、定标准g高倍视野下观察，>30％肿瘤细胞内含有棕黄色颗粒且染色强度高于正常平滑肌细胞染色者判为“+，’；<30％肿瘤细胞染色强度高于正常平滑肌细胞或肿瘤细胞染色与正常平滑肌细胞相近者判为“4-”；肿瘤细胞染色强度低于正常平滑肌细胞染色者判为“一”。“+”者判定为VEGF．C阳性表达。MVD计数标准：先于100倍视野下扫视整个切片找到高血管密度区，即“热点”(HotSpot)，再以200倍视野下(0．7386mm2／视野)计数微血管数目，分别计数3个不同视野，取其最高值表示MVD。计数微血管时，无论是否有血

7、管腔，凡是呈棕褐色染色的单个内皮细胞、细胞簇，与邻近的组织有明确界限者均计数在内。血管腔大于8个红细胞直径总和及正常粘膜下区的微血管不计数在内。统计学处理：VEGF．C的表达与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、病理分期(pTNM)、淋巴结转移、术后生存期关系以#或四格表确切概率山东大学博士学位论文法检验；VEGF—C的表达与MVD关系以秩和检验；VEGF．C的表达与患者预后关系以SPSS统计软件绘制Kaplan．Meier曲线(生存率曲线)表示，生存率差异性检验采用时序检验。P<0．05被认为有显

8、著性差异。I结果1：VEGF．C阳性物质主要位于肿瘤细胞的胞浆内，肿瘤浸润边缘阳性染色强度高于肿瘤中心区域。在食管鳞癌组织中VEGF．C的阳性表达率为45．65％(21／46)，显著高于食管正常黏膜组织(尸