重组dna在大肠杆菌中的诱导表达

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1、实验报告题目:单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达指导老师:邓庆丽日期:2013/10/31-201311/1一．实验目的：(1)了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。(2)了解降解物阻遏的现象及其机理。二．实验原理：本实验使用的是载体是已重组好的pGFPuv，宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为融合蛋白，目的蛋白为绿色荧光蛋白GFP，非目的蛋白即融合部分为标签6×His，用于单元四的亲和层析分析。本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构

2、基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图1所示：乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。(1)诱导表达当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中的绿色荧光蛋白基因GFP）不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态，如下图2所示：当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动，于是，结构基因可

3、以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导，如下图3所示：乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。(1)葡萄糖降解物的阻遏作用代谢物基因激活蛋白（CatabolitegeneActivationProtein）CAP，又称cAMP受体蛋白属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合DNA促进乳糖操纵子的转录。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制乳糖操纵子的转录。

4、本实验使用的表达载体pGFPuv上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因表达的是带6×His的重组绿色荧光蛋白。在IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强105倍，并且可用金属螯合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。三．材料与试剂：(1)材料工程菌：BL21(DE3)p32a、BL21(DE3)pGFPuv(2)试剂LB液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeastextract）5g、NaCl10g，加800mL双蒸水溶解，用10MNaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。分装，高压灭菌，4℃保存。氨苄青霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20℃

5、保存，使用终浓度为50μg/mL或100μg/mL。IPTG溶液（100mM）：将238.3mgIPTG溶解于10mL双蒸水，0.22μm细菌滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用，贮存浓度为100mM。20%葡萄糖溶液超声平衡缓冲液：50mMTris-HCl,500mMNaClpH7.0四．实验仪器：超净工作台、低温摇床、高速冷冻离心机、超声破碎仪等。五．实验步骤、现象、结果及分析：1.工程菌的活化(10月30号教师准备)分别挑取工程菌BL21(DE3)p32a和BL21(DE3)pGFPuv的单菌落接种到5mlLB液体培养基（含氨苄，终浓度为100μg/mL，以下同）晚上7点接种37℃、25

6、0rpm培养14h过夜至对数生长期第二天早上9点左右取出放入4℃备用2.放大(10月31号)往装于500ml三角瓶中的170mlLB液体培养基中加入170μLAmp，摇匀，取三支灭菌试管，用5ml枪各加入5mlLB液体培养基(含氨苄），分别编号为1#，2#，3#，剩下的装于三角瓶中的液体培养基（含氨苄），编号6#，全部按1：50的比例接种菌种，操作如下：1#接种100μLBL21(DE3)p32a2#接种100μLBL21(DE3)pGFPuv3#接种100μLBL21(DE3)pGFPuv6#接种3mLBL21(DE3)pGFPuv下午接种于37℃、250rpm培养约2h，顺便配制单元四蛋白

7、质纯化及电泳所需试剂。3.诱导1#、2#不需处理3#加入20％葡萄糖250μL，至终浓度为1.0％；加入25μL100mMIPTG至终浓度为0.5mM。6#加入100mMIPTG约750μL至终浓度为0.5mM。于25℃、250rpm培养过夜4.收菌（注意采集标本并编号）（11月1号早上9点开始）从6#三角瓶培养的150mL菌液中取出5mL置于一支试管中（编号为4#）。(1)分别从2#，3#，4#