重组大肠杆菌高密度发酵中乳糖诱导表达

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1、第5卷第4期过程工程学报Vol.5No.42005年8月TheChineseJournalofProcessEngineeringAug.2005重组大肠杆菌高密度发酵中乳糖诱导表达hBLyS11221李兆鹏，张栩，徐斌，宋礼华，谭天伟(1.北京化工大学生命科学学院，北京100029；2.安徽安科生物工程有限责任公司，安徽合肥230088)摘要：研究了乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达重组人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS).结果表明，乳糖不仅能够作为诱导剂诱导外源蛋白的合成，而且能作为碳源促进菌体的生长.通过对诱导条件进行优化，乳糖诱导外源蛋白的表达量约占菌体总蛋白的14

2、.3%，达到IPTG的诱导水平(26%)的55%.在5L发酵罐中hBLyS的表达量达到16%，同时生物量OD600=62.关键词：大肠杆菌；乳糖；IPTG；hBLyS中图分类号：TQ92文献标识码：A文章编号：1009−606X(2005)04−0446−041前言hBLyS重组质粒，由徐斌提供.人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)属于肿瘤坏死因子试管种子培养及二级种子培养基均选用LB培养基(TNF)超家族成员，在体液免疫调控中起重要作用.它(g/L)：tryptone10,yeastextract5,NaCl10；发酵罐中基能强烈刺激B淋巴细胞的增殖和分化并分泌大量免疫础培养基为半合成培养基

3、(g/L)：glucose2.5,tryptone10,球蛋白；在体外过量表达能促进多种B系肿瘤细胞的生yeastextract5,KH2PO42,K2HPO44,NaH2PO4⋅12H2O7,[1][2][3](NH)SO1.2,NHCl0.2,MgSO⋅7HO0.2,NaCl1,去长.其在原核和真核表达系统中的表达均有报道.424442在构建基因工程菌株时，常将外源基因安置在可被泡剂0.2mL/L；补料液(g/L)：glucose150,MgSO4⋅7H2O诱导控制的启动子序列下游.实验室小规模样品制备中5；乳糖诱导液(g/L)：lactose200,yeastextract50;IPT

4、GIPTG是常见的诱导剂，但由于其昂贵的价格和潜在的诱导液(g/L)：238.3.全部培养基pH值均调至7.0,116℃毒性，使其应用于大规模发酵生产重组蛋白时有一定的灭菌后加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL.[4]2.2试剂局限性.乳糖是一种二糖，无毒性且价格低廉，可以作为诱导剂启动PET载体中的T7启动子，从而开始目Tryptone,yeastextract购自Oxoid公司；IPTG,[4]acrylamide,N′N-methylene-bis-acrylamide,SDS,glycine,的蛋白质基因的转录.Kweon等发现，在摇瓶中1mmol/L乳糖诱导表达PIP(Ribos

5、ome-InactivatingProtein,Tris购自Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯.pMS质粒，E.coliTG1)，发酵液中目的蛋白的最终含量2.3培养方法(21.4mg/L)达到IPTG诱导下表达水平(38.7mg/L)的2.3.1种子液[5]挑取单菌落接种于50mL(250mL锥形瓶)含10055%左右.Woyski等使用乳糖诱导表达细胞色素P450(PET22b质粒含T7启动子)，在乳糖的诱导下P450μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃,160r/min摇表达量最终达到12mg/L以上，超过了1mmol/LIPTG床(HYG−A型全温摇床，太仓市实验设备厂制造

6、)培养诱导的效果.虽然乳糖的诱导效果不及IPTG，但因其价6~8h，使菌体生长达到对数生长期(OD600≈1.0).格低廉，能大大降低诱导成本，使在重组E.coli表达外2.3.2摇瓶培养源蛋白质的发酵中代替IPTG作为诱导剂的研究有着十将种子液以4%的接种量加入25mL(250mL锥形分重要的现实意义.本工作以大肠杆菌BL21(ED3)菌株瓶)LB培养基中，37℃,180r/min摇床培养2~4h，当为宿主菌,研究了乳糖诱导表达克隆在PET−22b载体菌体生长达到对数生长期(OD600≈1.0)时，加入诱导剂开中的人B淋巴细胞刺激因子基因.始诱导，诱导后摇床转速与培养温度不变.2.3.3发

7、酵罐培养2材料和方法批式培养：在5L生物反应器(上海保兴生物设备工2.1菌株和培养基程有限公司制造)中加入LB培养基3L，116℃灭菌，接EscherichiacoliBL21(ED3)含pET−22b(Novagen)/种量4%，通气量3L/min.通过流加1.5mol/LNaOH和收稿日期：2004−09−13，修回日期：2004−11−18基金项目：国家863基金资助项目(编号：2002AA217022