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1、大肠杆菌高密度发酵研究进展第22卷 第6期 中 国 预 防 兽 医 学 报 Vol.22, No.62000年11月 ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine Nov. 2000大肠杆菌高密度发酵研究进展柴家前1,陆庆泉1,沈志强2,刘吉山2(1.山东农业大学动物科技学院,泰安 2710185; 2.山东滨州畜牧兽医研究所,滨州 256618)中图分类号 S852.612 文献标识码 A 文章编
2、号 1008-0589(2000)06-0471-03 大肠杆菌被广泛地用于基因工程菌的构建,以获得大量的外源基因产物,利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。生物工程菌发酵的目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主,载体和目的基因三者之间的相互关系,而且与其所处环境条件息息相关。因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出适于外源基因高效表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度培
3、养是近几年发酵工业的目标和方向[1]。近几年,人们对高密度发酵(highcelldensityfermentation)进行了大量的研究,并取得了可喜的成果。对于大肠杆菌,尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲,实现高密度发酵,可相应地缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用,从而降低生产成本,达到提高生产效率的目的。本文就大肠杆菌高密度发酵的影响因素,发酵工艺等进行了综述,并探讨了如何提高大肠杆菌高密度发酵工艺技术水平。1 高密度发酵的影响因素利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组建的基因工程菌的表达产物,大肠杆菌的生
4、物量,表达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低,难以获得理想的生产效率和经济效益。应用高密度发酵不但可获得较高的生物量,而且可显著提高目的基因表达产物的浓度。高密度发酵对发酵设备有较高的要求,而且对发酵条件也有非常高的要求。影响高密度发酵的因素非常多,如细菌生长所需的营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的pH值、补料方式及发酵液流变学特性等。1.1 营养源 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质,以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要。高密度发酵对基质
5、中营养源的种类和含量也比一般发酵方法的要求高。但基质中营养物质的浓度过高,超过一定的限度可使生长抑制物质大量积累,使大肠杆菌的生长繁殖和目的基因表达受到抑制,从而使生产效率下降。常规基质中营养物的比例对高密度发酵 收稿日期:1999-10-05条件下大肠杆菌的生长是不适宜的。为了获得高密度发酵的理想结果,需要对基质中营养物质的配比进行优化,以满足细胞旺盛的新陈代谢对营养物质的大量需要。大肠杆菌高密度、高表达发酵控制中优化碳源是关键因素。由于细菌利用葡萄糖生长速度快,并且测定方便,成为大肠杆菌发酵中最常用的碳源物质
6、[2,3]。但基质中高浓度糖的存在会导致乙酸的形成,Riesenberg[4]曾报道当糖浓度超过50g·L-1后E.coli的生长受到抑制。因此保持基质中较低的碳源浓度是达到高密度和高表达的关键因素。陈坚,李寅[5]等就培养模式对大肠杆菌高密度培养生产谷胱甘肽的影响的研究表明,糖浓度为10g·L-1下发酵重组大肠杆菌WSH-KE124小时细胞干重达到最大(4.60g·L-1),各时刻细胞内GSH含量均高于其它糖浓度。李民,陈常庆[6]等对高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A的研究也表明,基质中初糖浓度为1
7、0g·L-1时细胞密度和产物表达量均获得了较好的效果。由此来看,其质中初糖浓度为10g·L-1左右时,重组大肠杆菌的高密度发酵,基质葡萄糖的浓度可能要高于10g·L-1。以甘油代替葡萄糖作为细菌生长的碳源可减少代谢抑制物质—乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达[7,8]。杨汝燕等[9]对基因工程菌高密度发酵液中的碳源物质甘的定量检测及其浓度的优化控制进行了研究,结果表明,其质中的甘油浓度在5g·L-1对重组大肠杆菌进行发酵,最终密度达到120DO600,重组蛋白rhTNFα的表达量占菌体总蛋白的3
8、0%以上。在营养源对大肠杆菌高密度发酵的影响的研究中,就碳源对发酵的影响作了大量的工作。但在高密度发酵中,基质内的其它营养物质,如氮源、微量元素,碳氮比,各种无机盐的含量等对细胞的生长繁殖和基因产物的表达也有很大的影响,因此需对之进行优化。徐皓,李民[10]等在对高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子的研究中,就基质含磷量对发酵最终菌体密度和hrTNFα-DK2表达量的影
