实验大肠杆菌半乳糖苷酶诱导表达

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1、马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼117；电话：62336016；Email:myc0307@gmail.com现代微生物学实验技术实验内容♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣转座子随机突变及目的表型的筛选♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达♣利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达张妙直实验目的1.加深对大肠杆菌乳糖操纵子的理解；2.证实β-半乳糖苷酶是诱导表达的，且该酶的合成受到严格调控。乳糖操纵子调节基因结构基因ipozya控制单元操纵基因结构基因调节基因启动

2、子阻遏物ß-半乳糖苷酶透性酶乙酰基转移酶负调控模型诱导物：乳糖或IPTG实验原理操纵基因结构基因调节基因启动子ß-半乳糖苷酶透性酶乙酰基转移酶操纵子正调控模型cAMP-CAP复合物CAP结合位点调节基因结构基因ipozya控制单元实验原理大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一类诱导酶♣无作用底物(乳糖或半乳糖苷)时，几个分子/细胞；♣中性培养基中加入乳糖(诱导物)，103~105倍；♣IPTG，不被分解，比乳糖提高~3倍；♣葡萄糖效应：葡萄糖和IPTG，被显著阻遏；♣葡萄糖+IPTG+cAMP，不受葡萄糖影响。实验原理邻硝基苯酚-β-D-吡喃型半乳糖苷ONPG

3、Β-半乳糖苷酶邻硝基苯酚ONP+乳糖420nm下吸光度实验原理实验材料菌株大肠杆菌(E.coliK12)2.培养基及试剂(1).基本培养基(M9培养基)KH2PO430g；Na2HPO460g；NaCl5g；NH4Cl10g。溶解后加水至1L，121℃灭菌20min。灭菌后，在100mlM9中加入：0.1mol/LMgSO410ml,0.01mol/LCaCl210ml,加无菌水至1L，作为基本培养基。(2).2×YT培养基蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl5g，加去离子水至1L。(3).Z缓冲液每升含有一下成分：Na2HPO4·12H2O(0.

4、06mol/L)21.5gNaH2PO4·2H2O(0.04mol/L)6.2gKCl(0.04mol/L)(0.01mol/L)0.75gMgSO4·7H2O(0.001mol/L)0.246g巯基乙醇(0.05mol/L)2.7mlpH7.0(4).其他试剂10%甘油，10%乳糖，10%葡萄糖，IPTG(200mg/ml),ONPG(4mg/ml),1mol/LNa2CO30.1%SDS,氯仿3.主要仪器可见光分光光度计，摇床实验步骤大肠杆菌中β-半乳糖苷酶的诱导合成菌悬液制备将E.coliK12接种到固体2×YT平板上进行活化，挑取单菌落接种

5、至5ml2×YT液体培养基中，37℃培养过夜，2%的接种量接种至25ml甘油培养基中，37℃培养18h，作为下面实验接种用的种子液。分5组实验，准备5份种子液。注：平板不要大家准备周四晚上7点来接种—5ml试管周五下午两点来接种—25ml三角瓶2.酶的诱导合成及其调控分组进行，实验结束后全班集中整理出总的实验结果每组：A.25ml基本培养基的三角瓶B.21个2ml离心管，加入20μl0.1%SDS和40μl氯仿，盖严后至于冰浴；C.10个2ml离心管，测OD600.第一组：乳糖对β-半乳糖苷酶的诱导(1).往25ml基本培养基的三角瓶中加1ml10

6、%的甘油；(2).接种25ml生长在甘油培养基18h的菌液，计时，并取1ml测OD600；(3).30℃水浴摇床振荡培养1h，取1ml并测OD600值。然后向培养基瓶中加1ml10%的乳糖，摇匀并开始计时。立即取出500μl培养液到含有SDS和氯仿的小离心管中，至于冰浴中，此管为0min样品。培养瓶继续在30℃水浴摇床振荡培养；(4).每5min取500μl培养液用于测定β-半乳糖苷酶活性，共取10次，然后每10min取样一次，共10次。(5).每20min取1ml样品测OD600值注意：取样离心管要编号，并记录取样时间。第二组：无诱导剂时β-半乳

7、糖苷酶的(3).不加任何物质第三组：IPTG对β-半乳糖苷酶的诱导作用(3).30μlIPTG(200mg/ml)第四组：葡萄糖对乳糖诱导作用的影响(1).1ml10%葡萄糖；(3).1ml10%乳糖第五组：葡萄糖对IPTG诱导作用的影响(1).1ml10%葡萄糖；(3).30μlIPTG(200mg/ml)3.β-半乳糖苷酶活性的测定(1).将上述含样品的小离心管从冰浴中取出，置于30℃水浴中平衡10min；(2).在每个小离心管中分别加入500μlZ缓冲液和200μl底物ONPG(4mg/ml)，反应一直到黄颜色出现，加入500μl1mol/L

8、Na2CO3溶液终止反应（计时）(3).离心后取上清测OD420，值在0.2-0.8范围内，测定的结果较为可靠。4.β-半