嗜酸乳杆菌推定的β半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达

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1、嗜酸乳杆菌推定的β半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达作者：潘渠胡福泉陈恬邱岳王广科李晋川【摘要】目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β半乳糖苷酶基因lacZ，为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因，并构建表达载体pET22blacZH、pQE31HlacZ和pQE31lacZ，然后在大肠杆菌中诱导表达，并测定表达产物的β半乳糖苷酶活性。结果无标签的重组嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达，表达量可达2.28kU/L.而融合H

2、isTag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β半乳糖苷酶活性，即使复性也不能恢复。结论克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。【关键词】嗜酸乳杆菌；β半乳糖苷酶；克隆表达；HisTag；复性【Abstract】ObjectiveTocloneandexpressthelacZgeneofL.acidophilusinE.coliforresearchofthepropertiesoftheputativeβgalactosidase.MethodsThelacZgene

3、L.acidophilusATCC4356andakeabaseforresearchofenzymaticpropertiesandprobableapplicationinthefuture.【Keyily42，GH42）的β半乳糖苷酶基因。极端环境微生物中的GH42β半乳糖苷酶因耐热［8］、耐盐［9］、耐低温［10］或有特殊的底物而受到关注。嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶LacZ可能同极端环境微生物的GH42β半乳糖苷酶一样，具有某种独特的性质，从而应用于分子生物学研究或乳品工业。本实验设

4、计了3个克隆表达载体，试图在大肠杆菌中大量表达嗜酸乳杆菌GH42β半乳糖苷酶LacZ，旨在为后续的酶学性质研究提供依据。1材料与方法1.1菌株和质粒嗜酸乳杆菌ATCC4356购自中科院微生物研究所菌种保藏库，培养条件为：在37℃下，于MRS培养液［6］中静置培养24～48h.大肠杆菌JM109和Rosetta菌株是本实验室保存，培养条件为：在37℃下，于LB培养液中摇振培养过夜。选用本实验室保存的质粒pET22b和pQE31为表达载体。筛选条件为100μg/ml的氨苄青霉素。1.2嗜酸乳杆菌β

5、半乳糖苷酶基因的PCR扩增嗜酸乳杆菌基因组DNA的提取方法参考2结果2.1嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶基因的表达载体以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板的3个PCR均得到了预期条带。酶切、连接和电转化后，均筛选到了转化子。其中pQE31lacZ/JM109的转化子在筛选平板上呈现为蓝色菌落；而pQE31HlacZ/JM109的转化子在筛选平板上仍然呈现为白色菌落。这个现象提示pQE31lacZ/JM109菌株表达了有活性的重组β半乳糖苷酶，而pQE31Hlac菌株表达的重组β半乳糖苷酶可

6、能没有活性。双酶切、PCR（见图2）及测序证实3种重组质粒pET22blacZH、pQE31HlacZ和pQE31lacZ均构建成功。测序表明克隆序列和嗜酸乳杆菌NCFM菌株lacZ序列100%相同。序列提交GenBank，登录号为：EU590652.2.2重组嗜酸乳杆菌β半乳糖苷酶的表达形式经检测，在各诱导条件下，菌株pET22blacZH/Rosetta的超声上清液的β半乳糖苷酶比活力和对照菌株（pET22b/Rosetta）超声上清液的β半乳糖苷酶比活力都没有显著区别，

7、表明该重组菌株很可能不表达有活性的重组LacZ.SDSPAGE结果显示在全菌样品和超声沉淀样品中均存在一个显著的约70kDa（接近嗜酸乳杆菌LacZ的理论分子量76583Da）的表达条带，但是在超声上清液中却没有明显的70kDa表达条带（见图3B）。因此判定C端融合HisTag的重组LacZ的表达形式为包涵体表达。pQE31HlacZ/JM109在各诱导条件下的超声上清液中都测不到β半乳糖苷酶酶活，表明该重组菌株不能表达有活性的重组LacZ.SDSPAGE显示了和pET22blac

8、ZH/Rosetta相似的结果（见图3A），因此判定N端融合HisTag的重组LacZ的表达形式也为包涵体表达。pQE31lacZ/JM109在各诱导条件下均能在超声上清液中检测到β半乳糖苷酶酶活性，说明该菌株实现了无标签重组LacZ的可溶性表达。在诱导条件为25℃、0.4mmol/LIPTG和含0.5%乳糖的LB培养基时，超声上清液中β半乳糖苷酶活性最高，比活力达到1.14U/mg。据此推算，诱导后菌液中的β半乳糖苷酶单位约为2.28kU/L.SDSPAGE显示在超声上清液中有明