大肠杆菌粘附素faeg基因在乳酸乳球菌表面表达的研究

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1、厂—————————————————————————————————～————～llIill1111111111III]1111111111111IIIlY1804345大肠杆菌粘附素万aeG基因在乳酸乳球菌表面表达的研究摘要随着人们生活水平的提高和食品安全意识的增强，使用益生菌来生产畜禽用口服疫苗倍受人们关注。其中，乳酸菌是公认的安全级(GenerallyReoognizedAsSafe，GRAS)益生茵，具有天然抗菌、抗病毒和抗肿瘤的作用，用它作为口服疫苗生产的载体不仅安全，且具有益生作用，能提高动物健康水平，促进动物生长，改善饲料报酬，降低生产成本。FaeG是产肠

2、毒素大肠杆菌(EnterotoxigenieEscherichiacoli,ETEC)K88菌毛的主要粘附亚基，是导致断奶仔猪腹泻(Post-weaningdiarrhea，PWD)的重要因素。本试验以乳酸乳球菌NZ9000为宿主菌，以pNZ8112为表达载体，以知PG为抗原基因，以化脓链球菌M6蛋白的最后140个氨基酸为细胞壁锚定序列(CWAM6)，进行基因工程菌创制。将faeO和ClM6通过柔性肽连接，然后转入NZ9000，通过nisin诱导，使角PG在NZ9000的细胞壁表面表达，为开发预防PWD的口服益生菌疫苗做前期探索。1．参照GenBank上登录的K88ae

3、的．向gG基因保守序列设计一对PCR引物，上游引物引入印村酶切位点，下游引物引入印“酶切位点和柔性肽(G⋯GSG-S)序列。将PCR产物克隆到pMDl8．T载体上，测序结果显示该序列813bp，包含相应的酶切位点和柔性肽序列。与Genbank中的．庙PG序列比对，该序列437位的a突变为t，相应的氨基酸由Glu变为Val，683位的g变为c，该突变是一个无义突变，整个序列的读码框没有改变，表明本实验克隆到了加G基因。从碱基和氨基酸同源性比较看，相同血清型中的2个向eGab的同源性达99．6％，faeGac的同源性为55．90／o-100％：不同血清型相比较，faeGab

4、与faeGad的同源性为95．20／0-95．6％，faeGab与faeGac的同源性为54．90／o-70．5％，faeGad与faeGao的同源性54．90／0-69．5％。Bioedit软件疏水分析表明该蛋白亲水和疏水部分比例相近。抗原性分析表明抗原表位所占比列约为50％，主要分布在相应的疏水区域。2．根据Genbank上登录的化脓链球菌M6蛋白末端140个氨基酸碱基序列设计一对PCR引物，在上游引物引入印g，酶切位点和柔性肽序列(G·G-S—G·s)碱基，在下游引物引入日f”删酶切位点。测序结果显示PCR产物为457bp，在Genbank中进行序列对比，该序列第

5、33位的a突变为g，此处为设计引物时引入的一个无义突变，突变掉模板上该处的一个HindlII酶切位点。氨基酸序列与原始序列相同，且在106-110位有细胞壁锚定分拣信号LPSTG，表明本实验克隆到了M6蛋白的细胞壁锚定序列(cwa．6)。二级结构分析显示该氨基酸序列中甜螺旋占60．7％，为主要二级结构域。电荷分布预测显示这段氨基酸序列带有大量电荷，前114个氨基酸呈现正负电荷交替分布，后面一段主要是正电荷。疏水性分析显示该序列主要由亲水氨基酸残基组成，只有115．134位为疏水残基。3．通过酶切连接的方法来分级构建力PG细胞壁锚定表达质粒。首先将pMDl8．T-faeG

6、和pNZ8112用印甜和SpeI双酶切，然后用T4连接酶连接构建出pNZSll2-faeG，测序结果显示该重组质粒的序列与预期相符，开放读码框正确。再把pMDl8．T-awaa4e和pNZ8112和eG用印d和日加删双酶切，T4连接酶连接构建出pNZ8112-faeG．CwaM6。测序结果显示pNZ8112-faeG—C'WCIM6序列和开放读码框正确。4．将pNZ8112-faeO．C'WOM6电转入乳酸乳球菌NZ9000，经nisin诱导后，SDS．PAGE凝胶电泳没有检测到目的蛋白。提取经过诱导的NZ9000的mRNA进行反转录，并经PCR扩增后检测到faeG．C

7、3qOM6条带，说明融合基因已经进行了转录。将pNZ8112-faeG电转入乳酸乳球菌NZ9000，经nisin诱导后，SDS-PAGE凝胶电泳检测到了FaeG蛋白。本研究成功获得了faeG和CWaM6基因，构建了pNZ8112-faeG和pNZSll2一．角eG．o'WaM6表达载体，并检测到扣eG进行了表达，加eG．C'WCIM6进行了转录。关键词：乳酸乳球菌；faeG基因；细胞壁锚定序列；产肠毒素大肠杆菌IIRESEARCHONE．coliADHESIONGENEfaeOEXPRESSEDoNTHESURFACEOFL．1actis