人瘦蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究

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1、武汉科技大学硕士学位论文第1页摘要瘦蛋白是肥胖基因在脂肪组织中表达的产物，是反映体内脂肪组成及体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子。本研究参考相关文献设计引物，经68℃退火及30轮循环的PCR程序后克隆了位于质粒载体上的瘦蛋白基因约460bp的片段，将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMDl8．T洳序载体中进行序列测定。经测序鉴定正确后，直接对重组的pMDl8-T-OB测序质粒进行双酶切，并回收约460bp的瘦蛋白基因片段，然后把回收产物与同样经双酶切的pET-28a(+)表达载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后，挑选

2、在抗性平板上生长的菌落进行液体培养并提取质粒进行双酶切鉴定，从而最终获得重组成功的表达质粒。用构建的pET-28a(+)．0B重组表达质粒转化大肠杆菌DH5。及BL21(DE3)菌株，进行不同浓度IPTG、在不同时间下的诱导表达，然后对菌体蛋白进行SDS．PAGE分析，鉴定重组基因是否得到表达。结果表明，瘦蛋白在BL2l(DE3)菌株中得到大量表达，而在DH5。中则检测不出预期大小的蛋白质，这说明能高效表达人瘦蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)(pET-28a(¨-08)基因工程菌构建成功。关键词：瘦蛋白基因；PCR；测序载体：表

3、达；BL21(DE3)菌株第1I页武汉科技大学硕士学位论文AbstractLeptinistheexpressionproductofobesegeneinadiposetissue，anditisreflectedinbodyfatcompositionandbodyfatcontentandbodyweiglItregulationasanimportantsignalfactor．Thisstudydesignedprimersaccordingtorelatedliterature，andafterthePCRproce

4、dureswiththeannealingtemperatureof68℃and30cycles．theleptingenefragmentofabout460bpintheplasmidvectorwascloned．ThenthetargetfragmentWasrecoveriedfromtheagarosegel，andclonedintothepMDl8-Tsequencingvectorforsequencinganalysis．Aftertheidentificationwiththecorrectsequence

5、oftargetfragment，wedigestedtherecombinantsequencingvectorpMDl8-T-OBwithtwoenzymesdirectly,andrecoveriedthegenefragmentofabout460bp．ThenconnectedtheleptingenefragmentandthepET-28a(+)expressionvectorwiththesa／netwoen2ymcsdigestion．TheproductwagtransformedintocompetentE

6、．colicell，andselectedthecolonygrewOntheresistantbacteriaplateandvaccinateditintoliquidculture．TheplasmidWasextractedandidentificatedwithtwoenzymesdigestion，andtherecombinantplasmidwassuccessfullyconstructed．TherecombinantexpressionplasmidpET-28a(+)·OBwastransformedin

7、toE．coliDH妇andBL21(DE3)strains，thentheywereinducedwithdifferentIPTGconcentrationsandculturetimes．ThenthebacterialproteinwasanalysisedbySDS·PAGEtoidentifyiftherecombinantgenewasexpressed．TheresultsshowedthattherewasalargeamountofleptinexpressionintheBL21(DE3)strains，b

8、utfortheDH5astrains，thereWasnoproteinofexpectedmoleculeweight(forleptin，itisabout16700Da)couldbedetected．Theresultsindicatedthatthe