探索人瘦蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究

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1、X1213897分类号；UDC密级烈虞彳垮手羔夫哮学位论文人瘦蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究敖敬指导教师姓名：申请学位级别：论文定稿日期：学位授予单位：学位授予日期：刘建忠教授武汉科技大学化学工程与技术学院硕士专业名称：论文答辩日期：武汉科技大学化学工艺答辩委员会主席评阅人武汉科技大学硕士学位论文第1页摘要瘦蛋白是肥胖基因在脂肪组织中表达的产物，是反映体内脂肪组成及体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子。本研究参考相关文献设计引物，经68℃退火及30轮循环的PCR程序后克隆了位于质粒载体上的瘦蛋白基因约460bp的片段，将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMDl8．T洳序载体中

2、进行序列测定。经测序鉴定正确后，直接对重组的pMDl8-T-OB测序质粒进行双酶切，并回收约460bp的瘦蛋白基因片段，然后把回收产物与同样经双酶切的pET-28a(+)表达载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后，挑选在抗性平板上生长的菌落进行液体培养并提取质粒进行双酶切鉴定，从而最终获得重组成功的表达质粒。用构建的pET-28a(+)．0B重组表达质粒转化大肠杆菌DH5。及BL21(DE3)菌株，进行不同浓度IPTG、在不同时间下的诱导表达，然后对菌体蛋白进行SDS．PAGE分析，鉴定重组基因是否得到表达。结果表明，瘦蛋白在BL2l(DE3)菌株中得到大量表达，而在

3、DH5。中则检测不出预期大小的蛋白质，这说明能高效表达人瘦蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)(pET-28a(¨-08)基因工程菌构建成功。关键词：瘦蛋白基因；PCR；测序载体：表达；BL21(DE3)菌株第1I页武汉科技大学硕士学位论文AbstractLeptinistheexpressionproductofobesegeneinadiposetissue，anditisreflectedinbodyfatcompositionandbodyfatcontentandbodyweiglItregulationasanimportantsignalfactor．Thisstu

4、dydesignedprimersaccordingtorelatedliterature，andafterthePCRprocedureswiththeannealingtemperatureof68℃and30cycles．theleptingenefragmentofabout460bpintheplasmidvectorwascloned．ThenthetargetfragmentWasrecoveriedfromtheagarosegel，andclonedintothepMDl8-Tsequencingvectorforsequencinganalysis．Aft

5、ertheidentificationwiththecorrectsequenceoftargetfragment，wedigestedtherecombinantsequencingvectorpMDl8-T-OBwithtwoenzymesdirectly,andrecoveriedthegenefragmentofabout460bp．ThenconnectedtheleptingenefragmentandthepET-28a(+)expressionvectorwiththesa／netwoen2ymcsdigestion．Theproductwagtransfor

6、medintocompetentE．colicell，andselectedthecolonygrewOntheresistantbacteriaplateandvaccinateditintoliquidculture．TheplasmidWasextractedandidentificatedwithtwoenzymesdigestion，andtherecombinantplasmidwassuccessfullyconstructed．TherecombinantexpressionplasmidpET-28a(+)·OBwastransformedintoE．col

7、iDH妇andBL21(DE3)strains，thentheywereinducedwithdifferentIPTGconcentrationsandculturetimes．ThenthebacterialproteinwasanalysisedbySDS·PAGEtoidentifyiftherecombinantgenewasexpressed．TheresultsshowedthattherewasalargeamountofleptinexpressionintheBL21(DE3)str