中华蜜蜂apidaecin基因在乳酸乳球菌中融合表达

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1、中山大学硕士学位论文中华蜜蜂apidaecin基因在乳酸乳球菌中的融合表达专业：动物学硕士生：黄玉明指导老师：张文庆教授摘要apidaecin是一种从蜜蜂的淋巴液中分离到的多肽抗生素。主要对革兰阴氏性菌，尤其是人类肠杆菌科致病菌，具有很强的杀伤力，而对真核细胞没有毒性作用。因此，apidaeein在医药和食品工业中有着广阔的应用前景。泛素可以以分子内伴侣形式起到促进翻译和增加产物稳定性的作用，而且表达的融合蛋白在离体或体内条件下，经泛素特异性蛋白酶在泛素分子C一末端切割后，可以释放出完整而有活性的外源蛋白。这项被称为泛素融合的技术(ubiqu“m，fIlsiontechnology)

2、已开始应用于多种外源基因的表达及转基因植物研究领域。本研究设计一对简并引物，从中华蜜蜂(Apisceranacerana)中克隆了泛素基因的编码区。序列分析表明，该编码区的长度为228bp，编码的多肽由76个氨基酸残基组成，相对分子质量为8．57kDa，其等电点为6．79，同源性比较发现，中华蜜蜂泛素基因与其他真核生物泛素基因在氨基酸水平上具有96％以上的相似性。根据乳酸乳球菌的密码子偏嗜性，对原来的apidaecin基因进行了‘改造，以泛素(ubiquitin)融合蛋白的形式在乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)MGl363中表达了apidaeein。利用SDS—PAG

3、E在重组后的宿主苗中检测到特异蛋白带。ubiquitin-apidaecin融合蛋白不具备活性，为了能够去除泛素，得到有活性的apidaecin，从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中克隆一种泛素特异性蛋白酶YUHl，序列分析表明与GenBank中泛素特异性蛋白酶(YUI-11)基因的序列黄玉明中华蜜蜂apidaecin基因在乳酸乳球菌中的融台表达完全一致。克隆到的泛素特异性蛋白酶YUHl与乳酸乳球菌表达载体pMG36e连接构建表达载体，计划在乳酸乳球菌(Llactis)MGl363中表达，为获得有活性的apidaecin，进行了初步的探索。关键词：抗菌肽，a

4、pidaecin，泛素，乳酸乳球菌，融合表达，泛素特异性蛋白酶Ⅱ!当查兰堡主兰堡丝茎FusionExpressionofApisceranaapidaecinGeneinLactococcuslact／sMajor：ZoologyName：HuangYu—mingSupervisor：ProfessorZhangWen-qingAbstractApidaecin，apeptideantibioticwhichisisolatedfromlymphfluidofthehoneybee，hasstrongantibacterialactivitiesagainstGramnegative

5、bacteriabuthasnotoxicityoneukaryoticcells．Sothepeptidehaspromisingpossibleapplicationsinmedicineandfoodindustry．tyoiquitinappearstoreducevariabilityinexpressionyieldsandenhancesolubility,probablybecausetheyactascovalentlylinkedchaperonesandenhancethefoldingofthefusedprotein．Thebioactiveextrinsi

6、cproteincanbereleasedbyubiquitin-specificproteasesthatspecificallycleavetheisopeptidebondattheC-terminusofnhiquitin，invitroorvivo．Thisubiquitin一血siontechnologyhasbeendevelopedfortheexpressionofheterologousgenesandtheresearchontransgeneplant．InthisresearcIl’thecodingsequenceof却缸ceranaceranaubiqu

7、itingeneWasisolated．ThelengthofhisORFis228bp，encodingaproteinwithMrof8．57kDaandisoelectricpointof6，79，MultiplesequencealignmentindicatedthatA．ceranaceranaubiquitinisverysimilartothehomologousproteinsofothereukaryoticspeciesanditha