apidaecin功能基团和作用靶位点分析与其在乳酸乳球菌中的分泌表达

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1、浙江大学博士学位论文摘要Apidaecin型抗菌肽指由昆虫细胞诱导表达的一类富含脯氨酸(Pro．fieh)的、长度为18．20个氨基酸的抗菌肽，是目前己知的最大的Pro．rich抗菌肽家族。Apidaecin特异地作用于G-菌，在替代抗生素和抗感染方面显示出良好的应用潜力。本研究通过CD谱对apidaecin的结构进行了阐析，深入研究了apidaecin作用于G一菌的作用靶位点及其N．端和C．端基团的功能，并在构建乳酸乳球菌分泌表达载体的基础上，实现了apidaecin在乳酸乳球菌中的诱导、分泌表达。主要研究内容和结果如下：1．Apidaecin功能基团及其作用靶位点的分析通过固相肽合成方

2、法合成了apidaecin及其N．末端和C．末端片段，对其功能基团及与目标蛋白DnaK作用的靶位点进行了研究。对apidaecin及其N．末端和C．末端的功能分析表明，apidaecin能够迅速进入Ecoli细胞、显著抑制细胞胞内的B一半乳糖苷酶和碱性磷酸酶活性，并能够明显增强DnaK蛋白的ATPase活性，而其两个末端结构都不能进入Ecoli细胞。这表明，apidaecin的N．末端和C一末端都不含有与进入细胞和与靶蛋白相互作用的特定结构。通过CD谱分析研究了apidaecin与DnaK蛋白的D．E螺旋片段和LidlessDnaK蛋白的相互作用，结果显示，apidaecin能够与Lidl

3、essDnaK蛋白，即DnaK蛋白的基质结合位点作用，而不与DnaK蛋白的D．E螺旋片段作用。以上结果提示，apidaecin可能通过与DnaK蛋白的基质结合位点结合，并通过与基质竞争该位点而降低DnaK蛋白在细胞内的实际浓度，从而抑制Ecoli的B．半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的活性，最终抑制细胞正常代谢而死亡。基于双相电泳的蛋白表达图谱的初步研究表明，经apidaecin处理的EcoliK88的蛋白表达谱与未处理的蛋白存在9个有意义的差异蛋白质点，其中4个蛋白质表达下调，4个蛋白质表达上调，呈“全或无"改变的蛋白质点1个。以上结果将为富含Pro的抗菌肽的作用机理的研究提供重要的理论依据。2．

4、Apidaecin对哺乳动物Caco-2细胞和罗非鱼上皮细胞安全性评价分离和培养了尼罗罗非鱼(Oreochromisnilotica)肠道上皮细胞，并分别研究了三个浓度的apidaecin(10gg／ml，20}tg／ml和30gg／m1)对哺乳动物Caco．2浙江大学博士学位论文摘要细胞(共培养lh)和罗非鱼肠道上皮细胞(分别共培养24h和48h)生长形态、增殖、存活率、通透性、胞浆游离Ca+和磷脂酶A2活性等相关指标的影响。研究结果表明：10．30I，tg／ml浓度范围内的apidaecin体外对哺乳动物细胞和鱼的肠道细胞都没有显著影响(P>0．05)。该研究结果将为apidaecin

5、在抗菌及替代抗生素方面的应用提供科学依据。3．Apidaecin在乳酸乳球菌中的分泌表达根据乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，三．1actis)分泌表达规律，以Usp45信号肽作为信号肽序列，成功地构建了乳酸乳球菌分泌型表达载体sPNZ8048。将抗菌肽apidaecin基因克隆到sPN8048载体中，构建分泌型重组乳酸乳球菌表达载体sPNZ8048．ap，转化L．1actis受体菌NZ9000，得到重组菌L．1actis[spNZ8048．ap]。在nisin诱导、P．i。A启动子的调控和Usp45信号肽的正确引导下，apidaecin成功地分泌表达。TricineSDS．

6、PAGE显示表达的apidaecin分子量为2．0kDa左右，表明Usp45信号肽序列经正确的翻译后加工而切除。发酵上清液经分子量截至1000．3000超滤膜浓缩、Sephacryl．S．100HR填料的凝胶柱凝胶过滤及C18Vydaecolumn的RP．HPLC纯化获得了具有抑菌活性的表达产物。L．1actis[spNZ8048．ap】诱导培养液上清及其纯化产物的TricineSDS．PAGE凝胶电泳均得到了目的大小的条带，纯化蛋白的ESI．MS／MS质谱图谱在979．5．0m／z得到了一个大的分子离子信号峰[M+2H+】2+，即分子量为1957．0Da，与apidaecin的分子量大小

7、一致(1957．3Da)。在10ng／ml的nisin诱导表达4h的前提下，1L的apidaecin基因工程菌可以表达大约10mg的重组apidaecin。纯化产物的抑菌活性试验显示，重组apidaecin具有明显的抑制大肠杆菌K88的活性。关键词：Apidaecin；N一末端；C-末端；DnaK；细胞毒性；分泌表达浙江大学博上学位论文AbstractApidaecins(apidaecin—typepeptides)r