nisin基因在乳酸乳球菌中的表达与其发酵条件的研究

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1、中文摘要乳链菌肽(nisin)是某些乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L．1actis)产生的羊毛硫氨酸类细菌素，对芽孢、多种革兰氏阳性菌有强烈的抑制作用，对人体安全无毒，在食品、医药、畜牧业中有较好的应用前景。目前，nisin的生产菌株大都是通过天然菌株的筛选或诱变获得，其活力的提高和功能的改造受到一定的限制。因此，本研究在克隆nisA的基础上，利用DNA重组技术获得产nisin的重组乳酸乳球菌工程菌株，并优化了其发酵条件。主要研究结果如下：(1)以含有nisin前体基因(nisA)的重组克隆载体pUCm．T／LNI为模板(本实验室保存)，设计一对分别含有NcoI、XbaI的表

2、达引物，对nisin基因进行亚克隆，构建重组克隆载体pUCm．T／Nis。序列测定表明，亚克隆得到的nisin基因序列与原基因一致。(2)pUCm．T／Nis经NcoI和XbaI双酶切，与经相同酶切的乳酸乳球菌表达载体pNZ80连接，转化E．coliMCl061感受态细胞，经双酶切和PCR鉴定，筛选获得含重组质粒的阳性菌。提取重组质粒电击转化入乳酸乳球菌L．1actisLZ(nisA缺失株)，筛选得到含重组质粒pNZ80／Nis的基因工程菌一LlactisNIP。抑菌试验表明，L．1actisNIP发酵上清液对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽胞杆菌、李斯特杆菌等(G+菌)及嗜水气假单孢菌(G

3、-菌)都有明显的抑菌效果。(3)L．1actisNIP的发酵条件优化结果表明，产nisin的最佳发酵氮源、碳源和磷源分别是酵母粉、麦芽糖和磷酸氢二钾，添加量分别是1．5％、1．5％和3％；发酵最适初始pH为6．5，最适培养温度是28℃，发酵时间为14h，在上述优化条件下，L．1actisNIP发酵上清液中目的蛋白的抗菌活力(nisin效价)达到最高值5040IU／ml，比非优化条件下的效价提高了404％。以上结果为提高nisin产量和降低nisin生产成本提供基础，也为进一步深入研究nisin的结构与功能及扩大nisin的商业应用提供了一定的材料和理论基础。关键词：乳链菌肽；克隆；表达；乳酸乳

4、球菌；抑菌效价；发酵条件2英文摘要AbstractNisinisalantibiotic-typebacteriocinproducedbycertainstrainsofLactococcuslactis．Itcaninhibittheproliferationofmostgram-positive(∽bacteriaandsporegermination,anditissafeforhumanassalt．Nisinisusedinwiderangeoffoodproductsandithasgoodprospectinapplicationinmedicineandstockbreedi

5、ng．Nowadaysallthenisin-producinglatticacidbacteriawerenaturalstrainsisolatedfromnaturalortheirmutations．Anditisdifficulttoincreasethestrains’productionlevelandimprovethepropertyofnisin．Thereforegeneticengineeringnisin-producingstrainwasconstructedwithrecombinantDNAtechniquesandthekineticsofgenetieen

6、gineeringstrainfermentationwasalsostudiedtooptimizeitscultureconditionswithaimtoreducecostandimproveyieldofnisininthisresearch．Themainresultsobtainedareasfollows：(1)Tosub—clonenisA，primers5Plnand3PinwhichcontainNcoIandXbaIrestrictionenzymesites，respectivelyweredesigned，andnisADNAfragmentwasobtainedb

7、yPCRusingrecombinantplasmidpUCm—T／LNI；SequencingresultsshowedthatthesequenceofnisAWaSthesameasnisingene．(2)pUCm—T／NisfragmentwasthenligatedintoNcoIandXbaIsitesofpNZ80．Theligationmixturewastransformedi