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《重组人甲状旁腺激素肽（-）在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、重组人甲状旁腺激素肽（1-34）在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(3):26～30重组人甲状旁腺激素肽(1—34)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化木李健峰肖红剑姬秋彦李智华龙海亭阎玲梅罗娜徐维明(中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所昆明650118)摘要人工合成人甲状旁腺激素1～34肽段(PTH1-34)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pThioHis中,获得了高表达菌株.经发酵,破茵,金属螯合层析,反相层析和凝胶层析后获得了
2、纯度大于95%的hPTH1-34,hPTH1.34肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然PTH1.34一致.生物学活性研究表明,hPTH1-34在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用.关键词人甲状旁腺激素大肠杆菌融合表达人甲状旁腺激素(parathyroidhormone,PI1H)是生物体内由甲状旁腺主细胞分泌的一种多肽激素,在调节体液钙磷浓度维持相对稳定的过程中发挥着重要作用….PI1H分子是由84个氨基酸组成的一条直肽链,研究发现,完整的多肽对其生物学活性是非必须的,发挥钙磷调节作用仅需N端1～34氨基酸残基组成的
3、肽段【2l.PI1H1-34通过与受体结合后激活腺苷酸环化酶系统和蛋白激酶c的活性,改变骨吸收和骨合成的速率,影响骨代谢llJ.目前临床研究显示,PTH104在低浓度的间歇注射可以促进骨合成速率,提高骨质密度和骨质量,有效治疗低血钙导致的骨质疏松症-3J.传统的由动物组织中提取PTH的方法,效率和产量极低,限制了PTH的研究和应用,因此,利用基因工程技术高效地生产具有生物学活性的重组PTH134具有实际应用价值.利用基因工程技术,在大肠杆菌中高效融合表达了hPTH1-34,并对hPTH1—34发酵工艺和纯化工艺进
4、行了研究.l材料与方法1.1材料pThioHis—A质粒,E.coliDH5ct,E.coliBL21为本研究室保存;大鼠骨肉瘤细胞株ROS17/2.8来源于中收稿日期:2005-06-29修回日期:2005—10—31云南省自然科学基金资助项目(2005C0062M)通讯作者,电子信箱:xuwmyn@public.km.yn.cn国农业大学生物学院;羊抗人PI1H1.34抗体购自SantaCruz公司;cAMP放射免疫分析试剂盒购自中国原子能科学研究院;各种工具酶购自TaKaRa公司及华美生物工程公司;牛肠激酶
5、为本实验室酵母表达生产所得.1.2人PTH1-34DNA片段的合成,克隆及融合表达载体的构建在不改变氨基酸序列的前提下,选择来自WWW.kazusa.or.jp/code网站的大肠杆菌偏爱密码子,并考虑二级结构因素,设计了编码人PTH1-34的DNA序列.并在上游酶切位点BamHI和PTH1.34基因起始密码子之间引入编码肠激酶切割识别位点AspAspAspAspLys的碱基序列GACGACGACGACAAG.设计后的基因由TaKaRa公司合成后,与BamHI和EcoRI双酶切的载体pUC18连接.转化Ecoli
6、DI-15a,筛选重组子和测序后,获得了一个序列完全正确的质粒,命名为pUC18.PTH(1—34).质粒pUC18一erH(1—34)用BamHI和EcoRI双酶切切下1∞bp小片段,与用BamIII和EcoRI双酶切的pThioHis.A载体连接,获得了表达硫氧还蛋白(Thioredoxin)和PTH134融合蛋白的质粒pThioHis,PTH1-34.1.3工程菌的构建及融合蛋白的表达将表达质粒pThioHis—PTH1_34转化到E.coliBL21中构建了工程菌E.coliBL21一PTH1.34.该工
7、程菌接入含有50~g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中.37℃,180r/m,培养至OD6oo达O.4～0.6h,以终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导表达4h.取培养物1mI,离2006,26(3)李健峰等:重组人甲状旁腺激素肽(1—34)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化27心后采用SDS—PAGE鉴定表达量.Westernblot鉴定所表达的融合蛋白,～抗为羊抗人PTH1—34,二抗为碱性磷酸酶标记的马抗羊IgG.1.4发酵培养1.4.1培养基组成LB种子培养基:每L含蛋白胨10g,酵母粉5g,NaC15
8、g,pH7.0;高压灭菌,使用时加入氨苄青霉素至100p.g,/ml.发酵培养基:每L含蛋白胨6.67g,酵母粉3.33g,葡萄糖1.67g,KH2PO4?3H2O3.33g,NaC13.33g,MgSO4?7H201.67g,柠檬酸三钠1.33g;高压灭菌后使用.补料培养基:每L含蛋白胨20g,酵母粉10g,微量元素15ml,IPTG0.33g,维生素B10.033g,
